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ph. P. Boivin
Analyse par PCR (Polymerase Chain Reaction). Elle permet de détecter, même après un long stockage des échantillons, les souches de Fusarium qui étaient présentes au champ. ph. Boivin
Identification visuelle des espèces de Fusarium. L'IFBM continue à la pratiquer à côté de la PCR. Deux techniques très complémentaires. ph. P. Boivin
On sait que les champignons du genre Fusarium responsables de fusarioses des épis sur les céréales sont potentiellement producteurs de mycotoxines dites fusariotoxines, notamment de trichothécènes. Et aussi que toutes les espèces du genre ne se valent pas. Certaines produisent plutôt tel ou tel type de trichothécènes, certaines sont plutôt inféodées à telle ou telle céréale... Il est utile d'identifier ces Fusarium, c'est-à-dire les déceler et différencier chaque espèce, mais aussi de quantifier chacune, au champ puis durant le stockage des grains. Nous expliquerons ici pourquoi et comment avec les méthodes d'identification visuelle (pratiquée à l'IFBM depuis 2003), et de PCR (outil biomoléculaire désormais quantitatif). Sans oublier d'informer sur l'évolution des Fusarium sur orge de brasserie.
Au cours des huit dernières années, l'Institut français de la brasserie et de la malterie (IFBM) a mis en œuvre un observatoire systématique de la présence sur les orges de brasserie françaises des espèces de Fusarium. Chaque année, environ 200 échantillons représentatifs de l'ensemble des surfaces cultivées sur le territoire sont caractérisés par sa filiale Qualtech.
Identification visuelle des espèces de Fusarium : la méthode
La première méthode de détection et d'identification des espèces de Fusarium spp et Microdochium nivale sur grains de céréales est dite « visuelle ».
La méthode, décrite sur la figure 1, est référencée : « MH.03-16 version B Toutes céréales, Détection et identification des espèces de Fusarium spp. et Microdochium nivale sur grains de céréales par isolement mycologique semi-sélectif et identification mycologique ». Elle consiste d'abord à isoler les souches (c'est l'« isolement mycologique semi-sélectif ») puis à identifier les isolats après culture sur deux milieux sélectifs (« identification mycologique »). Tous les isolats sont identifiés selon les descriptions de Nelson et coll. (Nelson et autres, 1983).
Ce type d'analyse permet d'identifier chacune des espèces de Fusarium isolées mais aussi d'évaluer la proportion de contamination par chacune, autrement dit de les quantifier.
Ce qu'elle nous a appris
Évolution depuis 2003 : producteurs de TCT B...
Les observations réalisées depuis 2003 (Fournier et al., 2003, 2005, 2009 ; Boivin, 2005) ont mis en évidence une diminution de la présence des Fusarium producteurs de trichothécènes de type B ou TCT B (déoxynivalénol, nivalénol...), traditionnellement observés sur les céréales à petits grains (F. graminearum et F. culmorum), de 2003 à 2005, puis leur stabilisation en 2005 (Noel et al., 2004).
Fusarium graminearum, principal producteur de TCT B, a opéré un retour sur les orges de brasserie françaises en 2008 et 2009. Fusarium culmorum, quant à lui, est présent en général à un niveau très bas et ne semble pas avoir une affinité élevée pour ces orges de brasserie.
Globalement, les quantités d'espèces productrices de TCT B ont diminué ces dernières années.
... Producteurs de TCT A...
Cette observation doit être mise en parallèle avec l'augmentation des échantillons contaminés par les espèces productrices de trichothécènes de type A, ou TCT A (toxines T2 et HT2) que sont F. langsethiae et F. sporotrichioides.
En effet, un changement de l'équilibre des populations s'est produit en France. Observé la première fois en 2003, il a été confirmé par le suivi des récoltes jusqu'en 2009. Les observations visuelles ont permis de mettre en évidence une augmentation des souches de F. langsethiae et plus récemment de F. sporotrichioides, caractérisée comme principal productrice de TCT A dans les pays nordiques. En 2008 et 2009, bien que F. langsethiae ait été décrite sur les orges, la présence de F. sporotrichiodes a été mise en évidence.
Les souches isolées au début de la décennie ne présentaient pas un potentiel important de production de TCT A, cette caractéristique étant alors réservée à F. langsethiae. Ensuite, la caractérisation du potentiel toxinogène des souches de F. sporotrichioides isolées ces deux dernières années a montré que ces isolats sont très fortement producteurs de toxines T2 et HT2.
Même si la population de F. poae est stable et celle de F. sporotrichioides rare, la contamination globale par des producteurs de TCT A s'est accrue.
... et non producteurs de trichothécènes
Deux autres espèces sont majoritairement présentes sur orge. Il s'agit de F. avenaceum et de F. tricinctum, qui ne sont pas des producteurs de trichothécènes. Leur population reste stable et prédominante.
Ces espèces peuvent toutes les deux produire d'autres types de mycotoxines, appartenant aux familles des enniatines et de la beauvéricine.
L'identification visuelle, limites et atouts
Elle ne décèle pas les souches mortes
Mais l'identification visuelle de Fusarium après isolement et croissance sur milieu sélectif ne peut que traduire la présence de souches vivantes lors de l'analyse. Or il existe une mortalité des souches au cours du stockage. Ce phénomène de disparition de la viabilité des souches a été observé à plusieurs reprises avec un nombre d'isolats issus des grains qui diminue dans le temps.
Une analyse visuelle par isolement peut donc présenter un biais. En effet, l'absence d'un Fusarium vivant à un instant donné ne signifie nullement qu'il n'a pas été présent auparavant. Le genre Fusarium appartient à un groupe traditionnellement décrit comme « moisissures de champ » (en opposition aux moisissures de stockage). Il rencontre des conditions de croissance favorables (humidité, température, interactions avec la plante hôte) au cours de la croissance de la plante, avant la récolte. Il y produit des mycotoxines qui resteront présentes dans le lot de grains après la mort des souches productrices.
... mais les survivantes pouvant produire de nouvelles toxines au maltage
En revanche l'identification visuelle révèle les souches ayant conservé leur potentiel de revivification et qui peuvent se développer lors du maltage de l'orge.
Ce maltage est un procédé en 3 étapes (imbibition des grains, germination et séchage par pallier de température). La germination est une étape critique, car les grains sont incubés pendant une durée de 5 jours à un taux d'humidité (40-44 %) et de température (16-20 °C) favorables à la reprise de croissances des tissus mycéliens et des spores. Il a été montré qu'une reprise de croissance de l'ensemble des espèces du genre Fusarium est possible, impliquant une possible production de toxines supplémentaires au cours du maltage.
Identification par PCR : la méthode
Pourquoi ? Parce que l'ADN est spécifique et stable
L'ADN est une molécule située au cœur de la cellule, dans son noyau. La séquence de l'ADN, caractéristique de chacune des espèces de Fusarium, présente l'avantage d'être très résistante et d'exister toujours en conditions de faible humidité telles que celles du grain, même des années après la mort de l'organisme.
L'utilisation de la PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérisation en chaîne) à l'aide d'amorces d'amplification (auparavant validées en termes de spécificité d'amplification vis-à-vis d'une espèce) permet d'identifier avec une très grande certitude l'ADN d'une souche, donc son appartenance à une espèce donnée, et ceci même si la souche est morte.
Analyser même après stockage
Ainsi l'utilisation de la PCR permet de caractériser la présence de ces espèces même longtemps après la mort des tissus. Il est ainsi possible de réaliser l'analyse et la cartographie, d'une récolte même après une voire plusieurs année de stockage.
Par ailleurs, même quand ces souches sont mortes, les mycotoxines qu'elles ont pu produire, très stables, perdurent encore.
Comment ? Rappel
On le sait, la PCR est une technique imitant in vitro, la duplication de l'ADN, étape essentielle et préalable à la duplication cellulaire. L'utilisation d'une enzyme spécifique, ADN-polymérase ADN-dépendante thermostable, permet de reproduire la réaction enzymatique cellulaire de réplication de l'ADN. Cette réaction de duplication de segment du génome spécifique d'un organisme (une espèce, par exemple) est répétée dans un thermocycleur approximativement quarante fois. On peut déterminer directement l'appartenance d'un isolat à une espèce par l'intermédiaire des amorces utilisées.
Ainsi, en utilisant des amorces de polymérisation spécifiques à l'une ou l'autre espèce, il est possible d'identifier cette espèce dans un mélange d'ADN de composition complexe.
Sept amorces pour des espèces et d'autres pour des mycotoxines
Nous avons réalisé les identifications par PCR de F. graminearum, de F. avenaceum et de F. langsethiae avec des amorces dérivées des séquences publiées par respectivement Schilling et al. (1996), Turner et al. (1998) et Wilson et al. (2004). Pour les autres espèces, F. culmorum, sporotrichioides, poae et tricinctum, des amorces spécifiques ont été développées par le laboratoire de biologie moléculaire de l'IFBM (Fournier et al., 2005).
L'analyse PCR des mêmes échantillons a également été réalisée avec des amorces spécifiques à une voie de biosynthèse de mycotoxines (par exemple pouvant détecter en même temps et dans la même réaction toutes les espèces produisant l'un ou autre type de trichothécènes, indépendamment de la notion d'espèce).
Les étapes de l'analyse d'un échantillon par PCR sont décrites dans la figure 2.
Amplification et quantification
L'utilisation de conditions d'amplification avec établissement de la cinétique d'amplification en temps réel permet de quantifier l'ADN des espèces (Figure 3).
Résultats obtenus
Des confirmations
Certains résultats obtenus ont confirmé les résultats de l'identification visuelle.
En effet, le nombre d'échantillons contenant l'ADN du groupe de biosynthèse de TCT A a augmenté au cours des dernières années tandis que le nombre de ceux contenant l'ADN du groupe de biosynthèse des TCT B a diminué nettement montrant une diminution lente de ces producteurs. Dans le même temps, la population de F. tricinctum est restée stable alors que celle de F. avenaceum diminuait beaucoup.
Mais des différences
Nous avons pu observer que la quantité d'échantillons contenant l'ADN des F. poae, langsethiae et sporotrichioides a atteint une proportion de presque 30 %. Cette valeur est beaucoup plus haute que celle obtenue après l'analyse visuelle. Ceci confirme ce qui a été précédemment observé, à savoir qu'une forte proportion des souches infectant les grains perdent leur capacité à se développer après une certaine durée de stockage. L'observation nous conduit à conclure que cette perte de capacité semble différer selon les espèces.
Il est important de répéter que la capacité des souches de Fusarium à se développer après la récolte est une menace pour le maltage, en raison de ses étapes humides qui permettraient aux moisissures de croître et de re-contaminer les matières premières pendant le procédé de maltage. Néanmoins, les mycotoxines produites lors de la contamination au champ étant résistantes aux conditions techniques du processus (par exemple la chaleur ou pression), elles peuvent être présentes dans les produits finis et peu d'élimination a été observée du fait des procédés de transformation.
Des connaissances utiles
La France est un pays important pour l'exportation d'orge à malter. Le développement de stratégies efficaces de contrôle des procédés de maltage exige de disposer d'une bonne connaissance des espèces réellement impliquées mais surtout de l'équilibre et la dynamique des populations de Fusarium aussi bien que de la variation de la production de mycotoxines parmi les espèces de Fusarium.
Spécificité vérifiée
La spécificité génomique des amorces permettant de détecter les 7 espèces majoritaires de Fusarium retrouvées et détectées sur les orges de brasserie au cours des observatoires réalisés ont été validées sur un ensemble de 21 espèces de Fusarium référence, ainsi que sur la diversité de la sphère mycologique afférente à cette culture. En effet, un certain nombre de moisissures des genres Penicillium et Aspergillus (considérées comme des moisissures de stockage) et Alternaria (une autre espèce dite de champ) sont retrouvées à différents niveaux de contamination sur les orges (et sur l'ensemble des céréales de grandes cultures).
La sensibilité de la méthode de détection par PCR étant très forte (l'amplification peut mettre en évidence la présence d'une seule molécule d'ADN, témoin de la présence d'une seule cellule fongique), il convient de s'assurer de la spécificité des amorces sur une fraction la plus exhaustive possible de la population contaminante. En plus de la population fongique, la spécificité des amorces développée a été vérifiée sur l'ADN des plantes hôtes, essentiellement les céréales de grandes cultures, notamment l'orge.
Volet quantitatif
Pour chacune des amorces, un processus de développement et de validation des amplifications a été mis au point permettant de les utiliser en PCR quantitative. Cette technique permet, par établissement de la cinétique d'apparition des séquences amplifiées, de déterminer le nombre de molécules cibles présentes dans la réaction au début de l'amplification. Chaque cellule porte en effet un exemplaire de la séquence cible située sur le génome (présent en quantité unique au sein de la cellule). Le nombre de molécules cibles est donc directement proportionnel au nombre de cellules de l'organisme ciblé (la moisissure correspondant aux amorces spécifiques utilisées pour réaliser la réaction d'amplification en l'occurrence) en présence dans le tissu végétal dont est extrait l'ADN total.
Utilisations possibles
La spécificité des amorces permet de cibler une espèce en particulier, et la méthode de mesure de l'amplification en temps réel permet de quantifier le nombre de génomes donc de cellules présentes.
La méthode, si elle est utilisée avec des amorces permettant d'amplifier l'ensemble des Fusarium, permet d'établir la charge fusarique globale. Ainsi, par comparaison entre mesures, on peut estimer les variations de cette charge en fonction de paramètres appliqués. Cela permet d'évaluer l'influence des intrants (produits phytosanitaires), des conditions pédo-climatiques au champ ou de variations de conditions de maltage sur la croissance des moisissures.
La méthode est également applicable aux espèces dès lors que des amorces sont disponibles avec leur spécificité vis-à-vis d'une espèce donnée préalablement démontrée et que la méthode de quantification a été validée. La validation de la PCR quantitative pour les 7 couples d'amorces spécifiques de Fusarium a été réalisée selon la norme V03-110 (Analyse des produits agricoles et alimentaires - Procédure de validation intra-laboratoire d'une méthode alternative par rapport à une méthode de référence - Cas de méthodes d'analyse quantitatives). Les tests de normalité, linéarité, répétabilité et reproductibilité ont été réalisés selon un plan établi selon ce référentiel et transcrit en méthode interne de validation. Cette méthode est commercialisée par Qualtech.
<p>* Institut français de la brasserie et de la malterie, Vandœuvre-lès-Nancy.</p> <p>regis.fournier@ifbm-qualtech.com.</p> <p><b>Photo en médaillon : ces boîtes de Petri contiennent des souches de <i>Fusarium</i> sp. cultivées pour les identifier visuellement. L'IFBM utilise une méthode officielle.</b></p>
Figure 1 -
Les analyses visuelles sont réalisées sur un lot de grains. Après plusieurs cycles d'homogénéisation/ réduction de l'échantillon, 100 grains sont déposés sur DCPA. La pression qu'apporte ce milieu favorise l'émergence des Fusarium. Certaines espèces peuvent être identifiées à ce stade. Les thalles non identifiés sont repiqués sur SNA et PDA, et les caractéristiques de croissance et des conidies sont évaluées. L'utilisation d'une clé dichotomique permet dès lors d'identifier les espèces. L'identification est réalisée selon la méthode officielle MH.03-16 : version B.
Figure 2 -
L'ADN total d'une matrice végétale (ici, l'orge de brasserie) est extrait et dosé. L'amplification est réalisée avec des amorces spécifiques d'une séquence de l'espèce recherchée. Dans le cas de la détection, la révélation de la présence des fragments d'amplification est réalisée par séparation électrophorétique des fragments en gel d'agarose. Dans le cas de la PCR quantitative, la cinétique d'amplification est établie par mesure de la quantité de fragments générés et comparée à la cinétique d'amplification de fragments en quantité connue et contrôlée (standard de concentration).
Figure 3 -
Cinétiques d'amplification établie par mesure de la fluorescence en temps réel. à chaque cycle, la fluorescence, directement proportionnelle à la quantité d'ADN spécifique présent dans le tube est mesurée. Un standard « nombre de séquences cibles » est établi simultanément, qui permet de déduire le nombre de séquences cibles présentes dans un échantillon inconnu, dès lors que la mesure de fluorescence dépasse un seuil significatif.
Application de la PCR : répartition des contaminations sur la récolte 2009 et projets 2010
Un échantillon d'orge à sa sortie du champ est contaminé par une myriade de micro-organismes. Ne considérons que la contamination fusarique et les espèces de Fusarium prévalentes chez les orges de brasserie, telles que nous les avons définies lors des observatoires des années précédentes.
2009 et les sept couples d'amorce
2009 est la première année pour laquelle l'ensemble des échantillons a été analysé à l'IFBM avec les 7 couples d'amorces Fusarium spp. En effet, la validation de l'utilisation en PCR quantitative pour les espèces F. sporotrichioides, F. tricinctum et F. avenaceum a été réalisée cette année-là. Les résultats des mesures réalisées sont repris tableau 1.
La masse fongique propre à chacune des espèces et mesurée par PCR quantitative n'est pas un indicateur de la contamination en mycotoxine. En effet, bien que pour certaines (DON notamment), il ait été établi une relation entre quantité d'ADN et mycotoxine, la mesure par PCR ne quantifie que l'ADN. La relation masse fongique/mycotoxines dépend d'autres facteurs tels que les conditions pédo-climatiques et la contamination par chacune des espèces donc la compétition existant au sein de la communauté fongique locale. En revanche ces mesures sont utiles dans le sens où une contamination peut être surveillée rapidement et surtout suivie dans le temps.
À titre d'exemple, il a été possible de réaliser des suivis au cours du maltage, des différentes espèces individuellement et de surveiller leur comportement au cours de la germination de l'orge. Toutes les espèces présentes, bien que présentant une reprise de croissance, ne présentent pas la même dynamique et la reprise de croissance ne se fait pas au même taux, ni après le même temps de latence.
La répartition des différentes espèces est très hétérogène et aucune relation de présence dépendante d'une autre espèce n'a pour le moment été montrée. Les valeurs obtenues, notamment la médiane des valeurs mesurées, montrent un parallèle avec les observations visuelles réalisées jusque là, essentiellement sur la répartition des espèces. F. tricinctum est majoritairement présent et une grande proportion d'échantillons contient l'ADN de cette espèce en grande quantité. F. langsethiae et sporotrichioides, producteurs de trichothécènes de type A, ne sont pas le contaminant majeur, bien que la quasi-totalité des échantillons présente une contamination en toxines T2 et HT2. La présence de F. graminearum, très visible, est parfaitement cohérente avec les observatoires visuels ayant montré en 2008 et 2009 une recrudescence de cette espèce dans les orges de brasserie, mise en parallèle avec l'augmentation de l'incidence de la DON.
À compter de 2010
À compter de 2010, les mesures sont réalisées systématiquement sur les échantillons des observatoires des orges de brasserie.
Au champ, la PCR quantitative permet de suivre l'implantation d'une espèce sur la plante hôte. Il a déjà été montré par cet outil que l'apparition de l'ADN de F. langsethiae est parallèle à celle des symptômes petits grains noirs.
On peut aussi réaliser des suivis sur plusieurs espèces pour déterminer les espèces en présence avec leur ordre d'apparition et d'évaluer la compétition entre souches, non seulement pour l'envahissement du milieu mais encore suite à l'application de paramètres tels que les fongicides, les pratiques culturales, le stade physiologique du développement de la plante ou bien le climat.
Dans le cas du maltage, la technique permet de réaliser le même type de suivis individuels.
De plus, bien que certaines espèces de Fusarium présentent une affinité plus importante pour des plantes hôtes spécifiques, la plupart des espèces peuvent être détectables et quantifiable sur toutes les céréales de grandes cultures. Cette méthode commercialisée par Qualtech est donc applicable à toute espèce végétale, transformée ou pas.
