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dossier - qualité sanitaire des grains un enjeu majeur

Débris de récolte et risques de mycotoxines

Emmanuelle Gourdain*, Myriam Guillou*, Ivonne Gonzales-Rodriguez*, Delphine Hourcade* et Claude Maumené* - Phytoma - n°646 - août 2011 - page 18

Premiers résultats de recherche par PCR de Fusarium graminearum et Microdochium spp. dans les résidus de cinq grandes cultures
 ph. Arvalis

ph. Arvalis

Ci-dessus, résidus de colza. Dans notre étude, l'ADN de F. graminearum et de Microdochium sp. est quantifié début juin. Ces résidus pourraient donc être contaminants, mais moins que les cannes de maïs (médaillon en haut de page) bien plus chargées en inoculum.

Ci-dessus, résidus de colza. Dans notre étude, l'ADN de F. graminearum et de Microdochium sp. est quantifié début juin. Ces résidus pourraient donc être contaminants, mais moins que les cannes de maïs (médaillon en haut de page) bien plus chargées en inoculum.

Résidus de blé. En principe, un précédent blé est considéré comme moins porteur de « risque fusariose » qu'un précédent maïs. Mais, dans l'essai que nous avons réalisé, chaque gramme de résidu de blé contient au printemps un peu plus d'inoculum de fusariose qu'un gramme de résidu de maïs.      Simplement, à façons culturales comparables (par ex. non-labour sans broyage, comme ci-contre), il reste moins de chaumes de blé à l'hectare que de cannes de maïs, donc moins d'inoculum prêt à infester le blé suivant.      ... En fait le blé pourrait n'être pas toujours un précédent sans risque pour la fusariose à F. graminearum donc la contamination par le DON.

Résidus de blé. En principe, un précédent blé est considéré comme moins porteur de « risque fusariose » qu'un précédent maïs. Mais, dans l'essai que nous avons réalisé, chaque gramme de résidu de blé contient au printemps un peu plus d'inoculum de fusariose qu'un gramme de résidu de maïs. Simplement, à façons culturales comparables (par ex. non-labour sans broyage, comme ci-contre), il reste moins de chaumes de blé à l'hectare que de cannes de maïs, donc moins d'inoculum prêt à infester le blé suivant. ... En fait le blé pourrait n'être pas toujours un précédent sans risque pour la fusariose à F. graminearum donc la contamination par le DON.

On sait que la fusariose de l'épi du blé est une maladie induite par plusieurs champignons des genres Fusarium et Microdochium, et que les Fusarium sp. sont capables de synthétiser des mycotoxines contaminant les grains. Ainsi F. graminearum peut produire du déoxynivalénol (DON). Cette fusariotoxine est réglementée et, selon l'ANSES(1), l'exposition de la population au DON par l'alimentation peut poser problème. Or l'occurrence de F. graminearum sur une récolte de blé dépend de divers facteurs, en particulier la présence et la nature des résidus de la récolte précédente. Mais il manque encore des données précises permettant d'évaluer le risque. L'étude présentée ici en apporte de nouvelles ; de plus, elle valide une technique analytique qui sera productive en données futures, à savoir la PCR en temps réel.

Sur le blé, la fusariose de l'épi est causée par plusieurs espèces de champignons, en majorité Fusarium graminearum et Microdochium spp. Outre le risque de perte de rendement, la maladie peut s'accompagner de l'accumulation dans les grains de mycotoxines, dont le déoxynivalénol (DON). Cette toxine est réglementée en Europe depuis 2006 pour les blés destinés à l'alimentation humaine. Ainsi, le respect des limites réglementaires est devenu une condition d'accès au marché. De plus l'EAT, « Étude de l'alimentation totale » dont les résultats ont été publiés en juin 2011 par l'ANSES(2), a montré que l'exposition alimentaire au DON, venant surtout de produits céréaliers, représente un « risque ne pouvant être écarté pour certains groupes de consommateurs ». Le DON est un défimajeur pour les filières céréalières.

La question du précédent cultural et de ses résidus

Un rôle reconnu... et des inconnues

De nombreuses études ont mis en évidence l'impact des pratiques culturales et des facteurs environnementaux sur le développement de F. graminearum et la production de DON.

Parmi les facteurs de risque identifiés, le précédent cultural ressort comme un des principaux. Mais le classement des précédents par rapport au risque mycotoxines associé n'est pas le même partout. Ainsi, un précédent blé tendre est classé à risque faible en France et au Royaume-Uni, à risque moyen en Allemagne et en Suède, et à risque fort en Italie. Ces différences posent la question du rôle des résidus dans l'épidémiologie de la maladie.

La présence dans le sol de résidus de la récolte précédente est décrite dans la littérature comme déterminante, les Fusarium et Microdochium étant capables de survie saprophyte. Cette aptitude est particulièrement marquée chez F. graminearum (Wilcoxson et al., 1988 ; Naef and Defago, 2006). Elle reste peu documentée sur Microdochium spp.

Demain, davantage de résidus des cultures précédentes ?

Ainsi, les résidus de culture subsistant au sol constituent la source majeure d'inoculum primaire susceptible d'infecter la culture suivante (Luongo et al., 2005 ; Bateman et al., 2007 ; Caron et al., 2007). Or, le contexte à venir de réduction de 50 % des pesticides dictés par le plan Ecophyto 2018, associé à une augmentation du non-labour dans les exploitations, pourrait favoriser durablement la persistance de ces niches refuges pour l'inoculum primaire.

La caractérisation des résidus de culture quant à leur rôle dans l'épidémiologie de la maladie devient donc une composante particulièrement importante à étudier afin de proposer des outils de gestion adaptés visant à réduire les risques d'infection.

Des études existaient, mais...

Certaines études ont poussé les recherches jusqu'au suivi du potentiel infectieux sur différents types de résidus. Mais leurs méthodologies étaient très variables et leurs résultats parfois contradictoires (Khonga et Sutton, 1988 ; Dill-Macky et Jones, 2000 ; Caron et al., 2007 ; Köhl et al., 2007 ; Peyreira et al., 2008 ; Güo et al., 2010 ; Hogg et al., 2010).

Or le développement récent des méthodes (dites PCR en temps réel) de quantification de l'ADN sur des matrices diversifiées permet d'étudier de manière plus fine et plus rapide les espèces fongiques présentes sur ces résidus (Güo et al., 2010 ; Hogg et al., 2010).

La PCR, outil pour mieux comprendre

C'est pourquoi une étude de caractérisation de différents types de résidus a été entreprise à l'aide de cette méthode sur la station expérimentale de Boigneville. Couplée à ce dispositif, une enquête avec prélèvements de résidus dans les parcelles d'agriculteurs a été réalisée en collaboration avec le Comité technique blé dur de la région Centre d'une part et Bayer CropScience d'autre part.

L'objectif de cette étude était d'une part de valider la méthode d'analyse des espèces ciblées F. graminearum et Microdochium spp. par PCR en temps réel, d'autre part d'évaluer dans différents types de résidus en dynamique, ou lors de la floraison, leur potentiel infectieux.

Deux voies d'étude complémentaires

Suivi dynamique : 4 dates de prélèvements à Boigneville

Dans cette étude, des échantillons de résidus de betterave, colza, tournesol, blé et maïs récoltés en 2009 sont prélevés en continu sur 5 diagonales des parcelles identifiées. Les prélèvements sont réalisés juste à la récolte des cultures, puis en décembre 2009, avril 2010 et enfin début juin, à la floraison des blés. L'objectif de ce dispositif était d'évaluer la cinétique de F. graminearum dans le temps.

Sondage sur 30 parcelles en région Centre

Pour compléter l'étude réalisée sur la station de Boigneville et afin de multiplier les conditions pédo-climatiques, un sondage est réalisé dans la région Centre suivant la même méthodologie. Les prélèvements sont effectués uniquement lors de la floraison des blés (juin 2010).

L'objectif de ce dispositif est de faire un premier sondage en démultipliant les conditions pédo-climatiques et de suivre spécifiquement F. graminearum et Microdochium spp.

Gestion des échantillons

Les échantillons récoltés sont séchés dans des conditionneurs à une température n'excédant pas 60 °C pour éviter la dénaturation de l'ADN tout en stoppant l'évolution des champignons. Une fois secs, ces échantillons sont broyés, d'abord grossièrement via un broyeur à couteaux avec une grille de diamètre 4 mm, puis avec un broyeur à godets de 35 ml avec bille pendant 30 s. Les échantillons broyés sont conservés à + 4 °C jusqu'à l'analyse.

Extraction de l'ADN

50 mg de broyat de chaque échantillon sont aliquotés dans une plaque 96 puits. L'ADN total est extrait via un kit (Macherey-Nagel) puis dosé au spectrophotomètre et dilué à 10 ng/µl. La dilution est validée par un nouveau dosage au spectrophotomètre. Les ADN extraits sont conservés à – 20 °C en attente de l'amplification.

PCR en temps réel

Les quantifications de F. graminearum, Microdochium nivale et Microdochium majus sont réalisées en utilisant la technologie Taqman. Les amorces spécifiques à chaque espèce fongique recherchée permettent l'amplification de l'ADN du pathogène. Sa quantification est rendue possible grâce à l'utilisation d'une gamme standard réalisée avec de l'ADN de champignon pur. Les données brutes d'ADN de champignon obtenues sont ensuite normalisées par rapport à 100 ng d'ADN total. Enfin, les résultats sont exprimés en logarithme de la quantité d'ADN fongique par rapport à la quantité d'ADN total (végétal et champignon) de l'échantillon.

Résultats

Sondage : les deux espèces partout, mais des taux différents

La figure 1 présente les résultats du sondage en région Centre. Ce premier sondage permet de faire plusieurs constats.

D'abord, les deux espèces fongiques sont quantifiées sur les 5 résidus de culture étudiés.

Néanmoins la quantité d'ADN de F. graminearum est plus forte dans les résidus de betterave, blé et maïs comparativement aux résidus de colza et tournesol. Ce résultat peut s'expliquer par le fait que F. graminearum est un pathogène connu de la betterave, du blé et du maïs et non du colza et du tournesol. Néanmoins, même à des niveaux faibles, il semblerait que les cannes de colza et de tournesol puissent être colonisées par ce champignon.

Concernant Microdochium, la seule tendance nette est une quantité d'ADN un peu plus élevée dans les résidus de maïs.

Maïs et blé sont les plus infestés

En conclusion, et malgré le faible jeu de données, ce sondage permet de valider la méthode de PCR en temps réel utilisée sur les différentes matrices. Même si les niveaux d'infection sont difficiles à évaluer en valeur absolue, il apparaît en tendance que la population fongique est différente selon le type de résidus. De plus, on confirme que le blé et le maïs sont les résidus les plus infectés par F. graminearum.

Ces résultats préliminaires sont assez bien corrélés avec ceux de la littérature (Peyrera et al., 2008 ; Köhl et al., 2007).

Suivi dynamique

Les résultats du suivi dynamique sont reportés en figure 2. Deux types de cinétique se distinguent.

Il ne semble pas y avoir d'évolution dans le temps sur les résidus de maïs, de blé et de tournesol. Mais ce dernier reste toujours nettement moins infecté que les céréales.

En revanche la quantité de champignon détectée diminue dans le temps sur les débris de colza et surtout de betterave. Ces derniers, aussi contaminés que ceux du blé à la récolte (la betterave est sensible à la fusariose), sont les moins contaminés à la floraison du blé suivant, peut-être en lien avec une décomposition des débris plus rapide.

Il n'y a aucun cas où la quantité de champignon augmente dans le temps ; ainsi l'hypothèse d'une colonisation des résidus à la sortie de l'hiver n'est pas validée par cette étude.

Les résultats observés sur les prélèvements effectués lors de la floraison des blés confirment les résultats précédents à l'exception de la betterave.

À ce moment-là, deux groupes de précédents se distinguent : d'un côté le blé et le maïs, les plus fortement infectés et, de l'autre, le tournesol, le colza et la betterave.

Attention, c'est « au gramme de résidu » !

Néanmoins, ces résultats sont à pondérer par la quantité de résidus présente sur la parcelle à cette période. En effet, les résultats sont exprimés par gramme de résidus. Or en semis direct, la quantité de maïs au sol est nettement supérieure à celle d'un blé par exemple. La quantité d'inoculum sera donc elle aussi supérieure.

Le travail continue

Cette première étude confirme l'impact de la gestion des résidus sur la pression de l'inoculum. Elle offre une piste pour comprendre l'apparition de fortes teneurs en toxines dans des parcelles à rotation ne présentant a priori pas de risque agronomique particulier.

La validation de l'utilisation de l'outil PCR en temps réel pour l'étude des résidus permet de poursuivre le travail de manière plus approfondie en 2011. Cela devrait conduire à une meilleure caractérisation des résidus de culture quant à leur potentiel infectieux par rapport à F. graminearum et Microdochium spp, en lien avec leur composition biochimique notamment le rapport carbone/azote, leur capacité à être dégradé et le climat, composante indispensable à la compréhension de la maladie et non travaillé dans la présente étude.

Cette nouvelle expérimentation nous amènera à étudier également les espèces présentes sur les grains ainsi que les teneurs en mycotoxines permettant ainsi d'établir les liens, s'ils existent, entre potentiel infectieux sur résidus, quantité de champignon sur grain et toxines produites en lien avec le climat.

<p>* Arvalis-Institut du végétal, 91720 Boigneville.</p> <p>(1) Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail.</p> <p>(2) Avis de l'Anses, saisine n° 2006-SA-0361, EAT (Étude de l'alimentation totale) 2, 2006-2010. Voir aussi p. 13 de ce numéro.</p>

Figure 1 - Quantification moyenne de F. graminearum et Microdochium spp sur 5 types de résidus (tournesol n=10, colza n=7, betterave n=2, blé n=4, maïs n=7) prélevés lors de la floraison des blés en région Centre. Résultats exprimés par gramme de résidus.

Figure 2 - Quantification de F. graminearum sur 5 différents types de résidus (tournesol, colza, betterave, blé, maïs) prélevés à différentes période de l'année, lors de leur récolte, en décembre (entrée hiver), en avril (sortie hiver) et en juin (début floraison). Résultats exprimés par gramme de résidus.

Bibliographie

Bateman G., Gutteridge R.J., Gherbawy Y., Thomsett M.A. et Nicholson P., 2007 - Infection of stem bases and grains of winter wheat by Fusarium culmorum and F. graminearum and effects of tillage method and maize-stalk residues. Plant Pathology 56 : 604-615.

Caron D., Malavergne D. et Dupont de Dinechin L., 2007 - Impact of agro-environmental factors on the F. graminearum inoculum level and kinetics of ascospores release. In Colloque scientifique RARE Arcachon, France, pp. 11-12.

Dill-Macky R. et Jones R., 2000 - The effect of previous crop residues and tillage on Fusarium head blight of wheat. Plant Disease 84 : 71-76.

Güo X. W., Fernando, W. G. D., Bullock P. et Sapirstein H., 2010 - Quantifying cropping practices in relation to inoculum levels of Fusarium graminearum on crop stubble. Plant Pathology, 59 : 1107-1113.

Hogg A.C, Johnson R.H., Johnson J.A., Klouser L., Kephart K.D. et Dyer A.T., 2010 - Monitoring Fusarium crown rot populations in spring wheat residues using quantitative real-time polymerase chain reaction. Phytopathology 100 : 49-57.

Khonga E. et Sutton J., 1988 - Inoculum production and survival of Gibberella zeae in maize and wheat residues. Canadian Journal of Plant Pathology 10 : 232-239.

Köhl J., de Haas B., Kastelein P., Burgers S. et Waalwijk C., 2007 - Population dynamics of Fusarium spp and Microdochium nivale in cops and crop residues of winter wheat. Phytopathology 97 : 971-978.

Luongo L., Galli M., Corazza L., Meekes E., De Haas L., Van der Plas C.L. et Köhl J., 2005 - Potential of fungal antagonists for biocontrol of Fusarium spp. in wheat and maize through competition in crop debris. Biocontrol Science and Technology 15 : 229-242.

Naef A. et Defago G., 2006 - Population structure of plantpathogenic Fusarium species in overwintered stalk residues from Bt-transformed and non-transformed maize crops. European Journal of Plant Pathology 116 : 129-143.

Pereyra S. A. et Dill-Macky R., 2008 - Colonization of the residues of diverse plant species by Gibberella zeae and their contribution to Fusarium head blight inoculum. Plant Disease, 92 : 800-807.

Wilcoxson R.D., Kommedahl T., Ozmon E.A. and Windels C.E. 1988 - Occurrence of Fusarium species in scabby wheat from Minnesota and their pathogenicity to wheat. Phytopathology 78 : 586-589.

Résumé

La fusariose de l'épi est une maladie des céréales induite par un complexe de plusieurs espèces de champignons des genres Fusarium et Microdochium, ayant des caractères épidémiologiques différents, productrices ou non de toxines. Le réservoir principal de la maladie est constitué des résidus de la récolte précédente qui permettent la conservation des champignons. Même s'il est clairement établi dans les guides de recommandation européens que les résidus de maïs sont les plus favorables au développement des Fusarium, un certain nombre de questions se posent sur le rôle des autres types de résidus, notamment blés, tournesol, colza et betterave. Pour répondre à cette question, des résidus de différentes cultures ont été prélevés à différentes périodes puis analysés par PCR en temps réel pour leur quantité d'ADN de F. graminearum. Dans le même temps, une enquête a été menée dans la région Centre avec prélèvement de résidus pendant la floraison des blés afin d'évaluer leur potentiel infectieux. Cette étude a permis la validation de l'utilisation de la méthode PCR en temps réel sur résidus. De plus, il a été démontré des quantités de F. graminearum variable entre résidus ainsi que dans le temps.

Mots-clés : Polymerase Chain Reaction, PCR, fusarioses, champignon pathogène, résidus.

Summary

Symptôme de fusariose causé par F. graminearum (dit autrefois « roseum » vu la couleur de l'épi), qui peut produire du DON.

Symptôme de fusariose causé par F. graminearum (dit autrefois « roseum » vu la couleur de l'épi), qui peut produire du DON.

Fusarium head blight (FHB) is a widespread disease of cereals caused by a number of Fusarium species. Due to the production of mycotoxins, the disease poses a significant threat to food and feed safety. Crop debris are known to be the main inoculum source of many FHB causing species as these species can survive saprotrophically on plant residues. Nevertheless, the current national recommendations published in Europe are not consistent with respect to the risk posed for debris from different crop species. Therefore, there is a need to assess the inoculum potential of crop debris from different plant species. A first year study was carried out in Boigneville by sampling different kind of crop debris on soil over time. At the same time, a survey was done in the Centre French region by sampling during wheat flowering debris. Quantification of F. graminearum was realised by real time PCR. This first study leads to validate the use of real time PCR on debris. It also underlines that the amount of F. graminearum DNA is different between the kind of residues and over time.

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