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– Identification visuelle : la fluorescence montre qu'il s'agit de Pseudomonas fluorescents. – Mais est-ce P. fluorescens ou P. putida ? Seule une méthode moléculaire permet de le savoir.
– Dispositif de test d'effets de souches de Pseudomonas. – Les souches de Pseudomonas sont apportées au sol au moment du semis et leur effet sur la croissance de la plante est estimé par pesée de la masse sèche du système racinaire et de l'appareil aérien, 4 à 6 semaines après le semis.
– Pousse de pomme de terre ; sur cette culture un Pseudomonas est autorisé... en Suisse. – En France, le seul Pseudomonas autorisé comme produit phytopharmaceutique l'est sur semences de céréales. ph. N. Cornec, Arvalis
– Antibiose exercée par Pseudomonas sp. vis-à-vis de Gaeumannomyces graminis var tritici (Ggt). à gauche, développement du champignon cultivé seul ; à droite, développement du champignon en présence d'une souche de Pseudomonas.
Mais si, vous avez raison : vous avez lu les mêmes termes dans le dossier « Méthodes alternatives » de mars 2012. C'était dans l'article consacré aux Trichoderma spp. Non que nous manquions d'imagination ! Mais ce groupe de Pseudomonas est, chez les bactéries, l'équivalent des Trichoderma spp. chez les champignons. Et, comme eux, il est l'objet d'un intérêt accru en tant que moyen alternatif de protection des plantes. Faisons donc le point à son sujet.
Pseudomonas : diversité et identification
Un genre avec des utiles et des nuisibles
Le genre Pseudomonas regroupe des bacilles, à Gram négatif et oxydase +, aérobies stricts. Ces bactéries sont généralement mobiles, grâce à un flagelle polaire, et ne produisent pas de spores.
Le genre comprend plus d'une centaine d'espèces ubiquistes parmi lesquelles des agents pathogènes redoutables pour l'homme comme P. aeruginosa (bacille pyocyanique responsable d'infections nosocomiales) ou pour les plantes comme P. syringae responsable du chancre bactérien des Prunus.
Place des Pseudomonas fluorescents
Certaines espèces de Pseudomonas produisent des pigments, comme la pyocyanine produite par P. aeruginosa et les pyoverdines qui permettent de caractériser le groupe des Pseudomonas fluorescents. Au sein de ce dernier groupe, les espèces P. fluorescens et P. putida font l'objet de cet article.
À noter aussi : le genre Burkholderia, dont un représentant fait l'objet d'un autre article de ce dossier (p. 18 à 22), était autrefois confondu avec le genre Pseudomonas.
Pseudomonas et sols résistants aux maladies telluriques
Le phénomène : une lutte biologique spontanée
Connus depuis longtemps, les sols résistants aux maladies, parfois qualifiés de « suppresseurs » en dérivation du terme anglais « suppressive soils », sont des sols dans lesquels des maladies d'origine tellurique ne se manifestent pas ou de manière très modérée, malgré la présence d'un agent pathogène, d'une plante-hôte sensible et/ou de conditions environnementales favorables à l'expression des symptômes.
La résistance des sols est le plus souvent de nature microbiologique : des populations microbiennes autochtones du sol s'opposent au développement et à l'expression des activités infectieuses de l'agent pathogène. En d'autres termes, il s'agit de sols dans lesquels la lutte biologique se manifeste naturellement.
Les exemples de sols résistants les mieux connus et étudiés concernent les sols résistants aux fusarioses vasculaires et ceux résistants au piétin échaudage du blé dû à Gaeumannomyces graminis var tritici (Ggt).
Historique d'un regain d'intérêt
À la fin des années 70, début des années 80, il y a eu un regain d'intérêt pour ces sols résistants. On a alors montré le rôle joué par les Pseudomonas fluorescents, en particulier vis-à-vis de Ggt. En effet, un traitement thermique détruit la microflore thermosensible, qui est rétablie par l'introduction de Pseudomonas fluorescents.
Ces bactéries particulièrement abondantes dans la rhizosphère des plantes ont fait l'objet de nombreux travaux pour décrypter leurs modes d'action en tant qu'antagonistes d'agents pathogènes mais aussi en tant que stimulatrices de la croissance des plantes. C'est pour désigner ces bactéries qu'a été forgée l'expression PGPR pour « Plant Growth Promoting Rhizobacteria ». Depuis lors, l'intérêt porté au groupe des Pseudomonas fluorescents ne s'est pas démenti, même si ces bactéries ont dû partager la vedette avec quelques autres genres bactériens, en particulier les Bacillus.
Isolement et identification
Étaler et éclairer
Les Pseudomonas fluorescents sont faciles à isoler du sol et de la rhizosphère des plantes par les méthodes traditionnelles de suspensions- dilutions et étalement sur un milieu. En effet, cette technique favorise la production de pyoverdine. Il s'agit d'un pigment qui émet une fluorescence caractéristique vert-jaune, sous rayonnement UV.
Il est donc particulièrement facile d'observer, sur milieu gélosé B de King, les colonies appartenant au groupe des Pseudomonas fluorescents. Il suffit d'exposer les boîtes de Petri sous une lampe émettant une lumière ultraviolette pour dénombrer les colonies fluorescentes.
Dans les années 80, on qualifiait de pseudomonas fluorescents toutes les espèces productrices de pyoverdine et partageant des traits de vie communs.
Du microscope aux méthodes moléculaires
Comme indiqué ci-dessus, au microscope, ces bactéries apparaissent sous forme de bacilles ; elles répondent négativement à la coloration de Gram et l'utilisation de galeries API basées sur la révélation de certains caractères physiologiques permet une première approche de l'identification des principales espèces.
Toutefois, il faut faire appel aux méthodes moléculaires pour différencier les espèces P. fluorescens et P. putida. Elles sont très proches et le séquençage des régions 16S de l'ADN ribosomique n'est pas suffisant pour les distinguer avec certitude. Il faut compléter l'analyse par le séquençage d'autres gènes comme le gène rpoB codant pour la sous-unité beta de l'ARN polymerase.
Biostimulants, biofertilisants : les modes d'action de type stimulateur de croissance
Mécanismes multiples
Les modes d'action grâce auxquels les Pseudomonas stimulent la croissance des plantes sont complexes. Ils relèvent de deux grands types de mécanismes : action directe sur la physiologie de la plante et action indirecte à travers la modification des équilibres microbiens dans la rhizosphère.
Dans la rhizosphère des plantes, ces bactéries utilisent les exsudats racinaires pour se multiplier ; elles produisent des métabolites secondaires extrêmement divers qui peuvent jouer le rôle d'hormones végétales et/ou de substances antagonistes vis-à-vis d'autres microorganismes. Une même souche bactérienne possède toujours plusieurs modes d'action qui s'expriment indépendamment ou simultanément. Il est difficile de faire la part entre ces différents mécanismes pour expliquer l'effet bénéfiques des PGPR.
Lorsque l'effet bénéfique sur la croissance peut être mis en évidence in vitro ou en conditions de sol désinfecté, on peut penser que les mécanismes agissant directement sur la physiologie de la plante sont prépondérants. Mais cela n'exclut pas, en sol non désinfecté, des effets indirects sur les équilibres microbiens qui défavoriseraient le développement des microorganismes délétères. On qualifie de délétères des microorganismes qui, sans être directement pathogènes, sont défavorables à la croissance des plantes.
La bataille pour le fer
La compétition pour l'espace et les nutriments, liée à une bonne densité de Pseudomonas dans la rhizosphère, joue un rôle essentiel dans les interactions plantes-Pseudomonas- autres microorganismes.
La compétition pour le fer est un phénomène largement répandu et particulièrement bien étudié en relation avec les activités bénéfiques des Pseudomonas.
Le fer ferrique (Fe3+) est un élément essentiel au métabolisme carboné et énergétique des organismes aérobies tels que les plantes et la microflore rhizosphérique. Les prélèvements de fer par la plante et la microflore contribuent à créer un environnement dans lequel l'intensité de la compétition pour le fer est plus forte que dans un sol nu.
Les Pseudomonas ont développé une stratégie active d'acquisition du Fe3+, basée sur la synthèse de sidérophores et de protéines membranaires réceptrices des complexes ferri-sidérophores. Elles sont particulièrement aptes à mobiliser le fer ferrique.
Le principal sidérophore produit par les P. fluorescens est la pyoverdine qui forme, avec le fer ferrique, un complexe très stable. La stabilité de ce complexe se traduit par une diminution de la concentration en fer ferrique disponible pour les autres microorganismes, en particulier les microorganismes pathogènes ou délétères pour les cultures. Au niveau de la rhizosphère, cette compétition pour le fer peut donc modifier la balance microbienne en faveur du développement de la plante.
Jouer le rôle d'hormones végétales
Les Pseudomonas sont également capables de produire des métabolites secondaires qui jouent le rôle d'hormones végétales et sont ainsi responsables d'une stimulation de la croissance des plantes.
De nombreuses souches de Pseudomonas sont capables de produire de l'acide indole-3-acétique (IAA), de l'éthylène, des cytokinines et des gibbérellines. Ces hormones synthétisées par la plante elle-même peuvent également l'être par les bactéries de la rhizosphère et en particulier les Pseudomonas. Les bactéries associées aux racines peuvent donc influencer la balance hormonale de la plante. L'éthylène fournit un bon exemple pour montrer que la balance hormonale joue un rôle très important dans l'effet des hormones (voir ci-dessous). À faible concentration, l'éthylène peut stimuler la croissance ! Alors qu'il est habituellement considéré comme un inhibiteur de la croissance et une hormone de sénescence.
Les bactéries associées aux racines sont capables de diminuer la concentration d'éthylène selon un processus assez complexe. La molécule 1-aminocyclopropane-1carboyclic acide (ACC) est un précurseur de l'éthylène chez les plantes.
Les bactéries productrices d'ACC-deaminase sont capables de dégrader l'ACC et ainsi d'en diminuer la concentration dans les racines.
Nutrition améliorée
La stimulation de croissance des plantes colonisées par des Pseudomonas fluorescents résulte également d'une nutrition minérale améliorée.
Les bactéries de la rhizosphère contribuent à la disponibilité de certains éléments comme le fer (cf ci-dessus) et le phosphore. Des éléments minéraux peu solubles peuvent être rendus disponibles par l'acidification du milieu due à la sécrétion de sidérophores et d'acides organiques par les bactéries.
Il a par exemple été démontré que l'aptitude d'une souche de P. fluorescens bien connue (CHA0) à solubiliser le phosphate minéral est dépendante de la production d'acide gluconique par cette souche.
Autres mécanismes de stimulation proposés
D'autres modes d'action ont également été proposés pour expliquer la capacité des Pseudomonas à stimuler la croissance des plantes, tels que la fixation d'azote, l'amélioration de l'assimilation de l'azote, ou la production de pyrrolopironnine quinone (PQQ)...
Il convient d'insister sur le fait qu'une même souche peut produire des dizaines de métabolites secondaires différents : seule une approche faisant appel à des manipulations génétiques permet de s'assurer de l'implication de tel ou tel mécanisme dans le mode d'action de la souche considérée (cf ci-dessous).
Bioprotectants : modes d'action comme agents de lutte biologique
Antagonisme par compétition
Au début des années 80, la production de sidérophores (la pyoverdine étant un sidérophore) capables de chélater les ions Fe 3+ a retenu l'attention des chercheurs. Cette capacité à séquestrer le fer permet aux Pseudomonas de modifier les interactions trophiques entre microorganismes présents dans la rhizosphère des plantes.
La compétition pour le fer entre Fusarium oxysporum pathogènes et Pseudomonas fluorescents a été mise en avant pour expliquer la résistance de certains sols aux fusarioses vasculaires.
Une équipe met à jour le rôle de la phénazine
La phénazine produite par certaines souches de Pseudomonas fluorescents joue un rôle clairement démontré dans l'antagonisme exprimé vis-à-vis de certains agents pathogènes tels que Ggt, agent du piétin échaudage du blé.
L'implication de cette molécule a fait l'objet pour la première fois d'une démonstration rigoureuse faisant appel à des manipulations génétiques. Il a ainsi été montré qu'un mutant de la souche 2-79 ne produisant plus de phénazine avait perdu sa capacité antagoniste vis-à-vis de Ggt alors que la souche complémentée avait à la fois retrouvé sa capacité à produire la phénazine et à s'opposer à la croissance de Ggt.
Effet conjugué reconnu à un autre métabolite... mais à la bonne dose
Mais expliquer l'efficacité d'un antagonisme microbien par un seul mécanisme est peu réaliste ; très rapidement, l'équipe nordaméricaine à l'origine des travaux sur la phénazine a montré le rôle majeur joué par un autre métabolite secondaire le 2,4-diacetylphlotoglucinol (2,4-DAPG).
Cette molécule est en fait impliquée dans l'antagonisme des Pseudomonas vis-à-vis de nombreux agents pathogènes. Elle interagit avec l'acide fusarique, métabolite secondaire produit par certaines espèces de Fusarium qu'elle contribue à détoxifier.
Mais il a également été montré qu'à forte concentration le 2,4-DAPG peut être phytotoxique !
Autres productions connues
Les Pseudomonas sont aussi producteurs de :
– pyoluteorin, métabolite secondaire qui inhibe les oomycètes, en particulier les Pythium spp et les maladies qu'ils provoquent,
– pyrrolnitrin, autre métabolite secondaire antifongique qui inhibe le développement de Rhizoctonia solani et de certaines espèces de Fusarium spp.,
– acide cyanhydrique impliqué dans l'antagonisme vis-à-vis de certains agents pathogènes dont Thielaviopsis basicola agent d'une nécrose racinaire chez le tabac.
Éliciteurs et cascade d'événements
Enfin, les Pseudomonas, comme de très nombreux microorganismes, élicitent les réactions de défense des plantes qui sont responsables de la résistance systémique induite (ISR).
Ce terme a été forgé pour différencier la résistance systémique induite par les PGPR de la résistance systémique acquise (SAR) induite par des molécules élicitrices de nature diverse...
En fait cette distinction entre ISR – qui implique plutôt les voies de l'acide jasmonique et de l'éthylène – et SAR – qui fait appel à la voie de l'acide salicylique et à la production de PR protéines – n'est plus aussi nette qu'elle l'était, au début des années 2000, lorsque qu'elle a été proposée. Nous savons aujourd'hui que ces diverses voies de signalisation sont interconnectées et nous avons indiqué ci-dessus que certaines souches de Pseudomonas produisent de l'ACC deaminase enzyme qui régule la production d'éthylène, molécule impliquée dans les voies de signalisation cellulaire.
Aujourd'hui, on préfère parler de l'immunité des plantes et des effecteurs microbiens qui induisent la cascade d'événements conduisant à la résistance ou à la sensibilité des plantes. Mais il est encore fréquent de trouver le terme SAR associé à la résistance induite par les PGPR et en particulier les Pseudomonas.
Cette résistance ne se manifeste d'ailleurs pas seulement vis-à-vis des maladies fongiques et bactériennes mais aussi vis-à-vis de certains insectes.
Quand la défense et la croissance se mêlent
Des métabolites secondaires comme l'acide salicylique, les brassinostéroides ou l'éthylène produits par certaines souches de Pseudomonas contribuent à la fois à renforcer les défenses naturelles des plantes contre les bioagresseurs et à stimuler la croissance des plantes. Contrairement au statut réglementaire qui différencie les biofertilisants et les agents de lutte biologique, il n'existe pas, au plan biologique, de différence entre les mécanismes de biostimulation et de bioprotection.
En fait, que peut-on attendre des Pseudomonas fluorescents ?
En pratique aujourd'hui
Pour pouvoir être utilisé comme agent de lutte biologique (autrement dit pour ses actions bioprotectantes), dans l'Union européenne, un micro-organisme doit être approuvé par le Règlement européen 1107/2009 en tant que substance phytopharmaceutique.
À notre connaissance une seule souche de Pseudomonas appartenant à l'espèce chlororaphis est approuvée comme telle. Cette souche MA 342 constitue la matière active de Cerall, biofongicide appliqué en enrobage de semences pour lutter contre plusieurs maladies cryptogamiques des céréales : carie, septoriose, fusariose.
Une autre souche de Pseudomonas sp., codée DSMZ 13134, est en cours d'examen par l'Union européenne (autorisée en Suisse contre le rhizoctone de la pomme de terre). Par ailleurs des produits fertilisants disponibles sur le marché contiennent diverses souches de Pseudomonas fluorescents, non homologuées pour des usages phytopharmaceutiques donc pour la lutte biologique. Dans certaines conditions, ces produits améliorent la croissance ou la vigueur des plantes et auraient des effets bénéfiques sur la structure des sols. Mais ces observations nécessitent d'être validées.
Cela devrait se faire par des expérimentations bien conduites, impliquant la mesure de paramètres pertinents.
Futur et réglementation
Nous sommes convaincus que les Pseudomonas, comme d'autres microorganismes promoteurs de croissance et agents de lutte biologique, doivent trouver leur place parmi les intrants agricoles.
Mais il est urgent d'harmoniser au niveau européen les conditions de mise sur le marché des microorganismes afin de garantir :
– un effet démontré, garant d'intérêt technico- économique pour l'agriculteur,
– l'innocuité vis-à-vis de la santé et la préservation de l'environnement (et/ou les conditions qui la permettent), indispensable au citoyen... et à la sécurité de l'applicateur et de toute personne exposée au contact de ces micro-organismes.
