Protéger l'oranger du Mexique de Phytophthora parasitica

Le biocontrôle à base de mélanges de micro-organismes, une piste de réussite pour contrer l'agent de pourritures racinaires qui attaque Choisya ternata ?

Appelé oranger du Mexique, Choisya ternata est un abuste de la famille des rutacées. Cette plante ornementale bien connue en France figure parmi les meilleures ventes de pépinière. Mais elle est difficile à cultiver...

L'origine des dépérissements

Des racines sensibles à l'excès d'eau

Choisya ternata est une espèce endémique des pentes rocheuses du sud des États-Unis et du Mexique. Cet habitat naturel assurant de très bonnes conditions de drainage permet une installation optimale du système racinaire de l'espèce, qui se montre extrêmement sensible aux excès d'eau. Cet environnement agronomique est idéal pour préserver son système racinaire fragile des pathogènes telluriques.

Choisya est un arbuste à feuillage persistant, trilobé, vert foncé et brillant (photo 1). Les fleurs, blanches, groupées en bouquets de 7-8 cm de diamètre, odorantes et mellifères, se développent entre mai et juin. Divers cultivars ont été créés afin d'obtenir une plus grande diversité de morphologie foliaire et florale et de nuances de couleurs.

L'une des maladies principales de C. ternata est la pourriture racinaire, qui apparaît régulièrement durant sa phase de production en pépinières. Cette affection induit un jaunissement et une perte de turgescence des feuilles, le brunissement des racines conduisant à la mort de la plante (photos 2 à 4).

Cette maladie induite par un ou plusieurs pathogènes telluriques entraîne des dégâts économiques lourds pour les producteurs. La sensibilité à la pourriture racinaire est vraisemblablement favorisée par des températures élevées et de mauvaises conditions de drainage du substrat.

Pathogènes telluriques du Choisya

Cinq grandes catégories

Divers pathogènes telluriques ont été isolés et identifiés à partir de racines de C. ternata présentant des symptômes de pourriture. Ces pathogènes sont Thielaviopsis basicola, Rhizoctonia solani, Fusarium spp., Pythium spp. et Phytophthora spp.

Des études précédentes suggèrent une prédominance du genre Phytophthora, précisément l'espèce Phytophthora parasitica. Cependant, l'hypothèse d'une pression sous forme de consortium pathogène (association de plusieurs agents) serait privilégiée.

Thielaviopsis, Rhizoctonia, Fusarium

Thielaviopsis basicola est un champignon tellurique à très large spectre d'hôtes. Il a été trouvé dans 137 genres végétaux, dont des plantes ornementales : Begonia sp., Cyclamen sp., Geranium sp., Euphorbia pulcherrima sp., Viola wittrockiana et C. ternata. Ses spores peuvent survivre près de vingt ans dans le sol.

Rhizoctonia solani est un champignon tellurique qui cause de fortes pertes sur de nombreuses espèces y compris ornementales. Il a été détecté sur racines de C. ternata malades, associé à des Pythium spp. La pourriture racinaire due à R. solani est favorisée en période sèche avec des températures allant de 17 à 26 °C.

Les champignons du genre Fusarium ont une très grande diversité génétique. Ils peuvent être pathogènes, saprophytes ou antagonistes. Les Fusarium pathogènes des plantes sont capables d'induire des nécroses chez de nombreuses espèces végétales.

Parmi les Fusarium pathogènes de Choisya, F. oxysporum provoque l'éclaircissement des nervures et le flétrissement accompagné de stries nécrotiques sur les tiges. La présence simultanée de F. oxysporum et Pythium ultimum est souvent observée. La présence simultanée de F. oxysporum et Phytophthora spp. sur C. ternata est plus rare.

Fusarium redolens est également identifié sur racines de Choisya. Ce pathogène tellurique à large gamme d'hôtes, notamment herbacés, peut causer le flétrissement de Choisya adultes.

Oomycètes : Pythium et Phytopthora

Pythium est un genre d'oomycète qui comporte plus de 120 espèces, en majorité pathogènes des plantes. Les Pythium spp. sont impliqués dans les fontes des semis et peuvent aussi infecter les racines de plantes adultes en provoquant des nécroses de l'apex racinaire. La présence de Pythium spp. sur Choisya a déjà été constatée sans identification des espèces.

Phytophthora est un autre oomycète. La Royal Horticultural Society (RHS) a identifié plusieurs espèces de Phytophthora pathogènes isolés à partir de Choisya malades : P. citricola, P. cryptogea, P. cinnamomi et P. nicotianae, autrement dit P. parasitica (il a été établi récemment qu'il s'agit bien de la même espèce). Par ailleurs, la présence simultanée de plusieurs oomycètes appartenant aux genres Phytophthora et Pythium sur un même plant de Choisya a été rapportée.

Phytophthora spp. peut causer une perte de 30 % à 80 % en culture de C. ternata. Parmi les espèces de Phytophthora isolés à partir de C. ternata, c'est bien P. parasitica qui est la plus souvent rencontrée.

Focus sur Phytophthora parasitica

Le cycle de P. parasitica comprend une phase végétative et une sexuée. La phase végétative produit des sporanges, des zoospores et des chlamydospores.

D'abord, le mycélium donne naissance à des sporanges. Ceux-ci germent, soit directement en formant des hyphes capables de pénétrer à l'intérieur des racines, soit indirectement via la production de zoospores. Les facteurs environnementaux (lumière et température) sont déterminants dans le « choix » du mode de germination. Les zoospores, mobiles car équipées de deux flagelles, localisent leurs cibles par chimiotactisme. Elles sont les agents infectieux majeurs de P. parasitica. Une fois posée sur une racine, la zoospore s'enkyste, germe et produit un appressorium qui pénètre la racine.

Quand les conditions environnementales ne sont pas favorables, le mycélium donne naissance à des chlamydospores (photo 5). Représentant la forme de résistance dans le sol, ces oospores peuvent rester viables pendant plusieurs années.

Moyens de lutte

Contre tous les telluriques

La protection préventive est le meilleur moyen de contrôler les maladies causées par les pathogènes telluriques, dont les oomycètes du genre Phytophthora. Ces méthodes de protection incluent la sélection de plantes saines et/ou résistantes, la stérilisation et la désinfection, le drainage et la gestion de l'irrigation. Le tout permet de limiter le recours aux produits phytosanitaires.

Phytophthora, l'inconnue du biocontrôle

L'utilisation de micro-organismes agents de biocontrôle (BCA, bio-control agents) est une autre voie prometteuse contre les pathogènes du sol. Mais elle est peu explorée face à Phytophthora.

Le biocontrôle est une des stratégies de lutte alternative à l'usage de produits phytopharmatiques de synthèse. Le principe est de privilégier les mécanismes naturels maîtrisant les populations d'agresseurs plutôt que leur éradication. L'utilisation de BCA fait partie des méthodes de biocontrôle. Son efficacité repose sur des interactions biotiques entre organismes visant des effets antagonistes au pathogène. Il existe trois groupes d'effets antagonistes :

- antagonisme direct (parasitisme et/ou prédation) ;

- antagonisme direct et indirect (antibiotiques) ;

- antagonisme indirect (compétition, induction de la résistance de l'hôte).

Plusieurs mécanismes peuvent être utilisés pour assurer ces effets antagonistes.

Les micro-organismes de biocontrôle (BCA) sont des solutions alternatives prometteuses pour contrôler les pathogènes du sol comme les oomycètes du genre Phytophthora. Parmi ces BCA, il existe des champignons filamenteux dont les « arbuscular mycorrhizal fungi » (AMF) et des bactéries, notamment des rhizobactéries qui, favorisant la croissance des plantes, sont dites « plant growth-promoting rhizobacteria » (PGPR).

Identification des espèces de Phytophthora en cause

Isolement : la technique des pétales-pièges

L'identification des espèces de Phytophthora pathogènes nécessite une étape d'isolement et une étape d'identification. L'isolement de souches de Phytophthora à partir de plants de Choisya ternata malades a été effectué par piégeage sur pétales d'oeillet blanc.

Cette technique consiste en une culture de racines de Choisya en milieu liquide contenant des pétales d'oeillets blancs. Ces derniers piègent l'oomycète, mais permettent aussi sa croissance. Avec cette technique, les tissus atteints par Phytophthora sont identifiés, et une culture sur milieu Corn Meal Agar (CMA) des micro-organismes présents sur ces tissus permet de les isoler.

Ensuite, une purification des souches sur milieu Corn Meal Agar (CMA) et CMA additionné d'antibiotiques est réalisée. Cette approche a permis d'obtenir une collection de souches isolées à partir de plants de Choisya ternata malades.

Identification en trois étapes

L'identification des souches de la collection est très importante pour le projet. Elle permet de savoir si les plants de C. ternata sont contaminés par une ou plusieurs espèces de Phytophthora, et ainsi de déterminer le niveau de spécificité de la qPCR à mettre au point. Cette identification a nécessité trois étapes :

- l'extraction de l'ADN des souches ;

- l'amplification de fragments d'ADN spécifiques des oomycètes ;

- le séquençage des amplicons.

Le séquençage des amplicons a permis la détermination des souches isolées à partir de plants de Choisya malades. Avec la caractérisation par séquençage des souches de la collection, deux genres principaux d'oomycètes ont été identifiés : Phytophthora et Pythium (Phytophthora tropicalis, Phytophthora parasitica, Pythium intermedium et Pythium spinosum).

En 2008, la clinique des plantes de la RHS avait identifié des Pythium et des Phytophthora sur des plants de Choisya, mais les espèces trouvées sont différentes des nôtres. La découverte de nouveaux parasites de Choisya ternata est un indice de la probable grande diversité de pathogènes attaquant cette plante, ce qui en fait un hôte très vulnérable et difficile à protéger.

Des travaux précédents d'Astredhor sur l'oranger du Mexique avaient permis de montrer que les espèces nicotianae (syn. parasitica), citricola et cinnamomi étaient également pathogènes de cette plante (Manasfi et al., Submitted).

Développer un outil moléculaire

Utiliser la PCR en temps réel

La quantification spécifique d'une espèce microbienne est possible par PCR en temps réel (qPCR). Cette technique permet de mettre en évidence la production des amplicons à chaque cycle grâce au suivi de la fluorescence émise par SYBR Green I qui se fixe sur l'ADN double brin.

La spécificité de cette PCR repose entièrement sur les amorces. Un travail préliminaire a permis de sélectionner plusieurs jeux d'amorces potentielles spécifiques des séquences multicopies au niveau du genre, pour mettre au point la PCR quantitative qui détecte Phytophthora spp.

Choix d'un couple d'amorces et conditions fixées

Finalement, un couple d'amorces a pu être sélectionné. Elles ciblent un gène impliqué dans le transport des vésicules entre les compartiments du réticulum chez une espèce de Phytophthora (Manasfi et al., Submitted).

Pour ce jeu d'amorces, les conditions de qPCR ont été optimisées en faisant varier en duplicats les concentrations d'amorces, de BSA ou T4, de MgCl2, les températures de fusion (Tm) et le temps de la phase d'hybridation des amorces. Ces modifications ont été effectuées afin d'améliorer la spécificité des amorces. Les conditions présentant la plus haute efficacité et la meilleure spécificité ont été choisies.

Tous les essais de qPCR ont été effectués avec l'ADN de la souche de référence de Phytophthora parasitica (P. parasitica 310 - collaboration avec Dr A. Attard, Inra Sophia Agrobiotech), mais aussi avec des souches de P. tropicalis. Ces amorces ont une bonne spécificité et donnent une efficacité qPCR excellente (100 %) avec les deux souches de Phytophthora.

Identifier des agents de lutte biologique

Tests avec inoculation artificiellepar Phytophtora parasitica

Plusieurs préparations, commerciales ou en cours d'expérimentation, de micro-organisme(s) bénéfique(s), proposées par des sociétés partenaires, ont été testées dans différents essais contre Phytophthora pour la protection du Choisya de 2015 à 2017 sur la station d'Astredhor Seine-Manche de Saint-Germain-en-Laye (vue de l'essai en photo 6 p 21). Les applications de BCA ont été réalisées aux dates et doses préconisées par les firmes partenaires.

Phytophthora parasitica a été sélectionné pour l'inoculation des plants car il semble la principale des espèces pathogènes isolées. Le choix de la dose d'inoculum à apporter a été validé en fonction des résultats obtenus sur des essais préliminaires réalisés en 2014. Cette dose est de 120 g de riz inoculé avec Phytophthora parasitica, soit 107 CFU/litre de substrat. L'inoculum a été administré un pot après l'autre, chacun étant un contenant de 4 litres (photos 10 et 11).

Chaque essai réalisé est au final découpé en deux parties : une fraction avec inoculation artificielle de Phytophthora parasitica et une fraction identique sans inoculation artificielle mais avec l'inoculum naturel éventuel potentiellement présent sur la pépinière.

Modalités et conduite des essais

Chaque essai comprend neuf modalités et quinze plantes par parcelle élémentaire, sauf pour le témoin non traité qui comporte dix-huit plantes. En effet, trois d'entre elles sont analysées au préalable pour observer la présence ou non de Phytophthora par qPCR. Le but est de s'assurer de l'absence de Phytophthora dans les substrats eux-mêmes avant l'inoculation.

Chaque plante représente une répétition : soit 153 plantes pour chaque essai, donc 306 plantes pour les deux essais et par an. Les modalités randomisées avec inoculation par P. parasitica sont séparées, pour éviter tout risque de contamination entre les deux fractions, par des modalités randomisées non inoculées. L'état sanitaire (arrêt de croissance, flétrissement de la plante, mortalité) a été noté quotidiennement durant ces essais. Des prélèvements ont été réalisés afin de suivre l'évolution des populations de Phytophthora dans le substrat à l'aide de l'outil moléculaire cité précédemment. Ces prélèvements ont été effectués à la mise en place de l'essai, puis un mois et deux mois après l'inoculation du pathogène.

Deux duos de champignons semblent prometteurs

Après trois années d'expérimentations et de nombreuses modalités testées (voir celles de 2015 dans le tableau), deux mélanges de deux espèces différentes de champignons ont montré une capacité à protéger des plantes en pépinière contre Phytophthora parasitica. Il s'agit de Glomus spp. associé à Gliocladium spp. et de Trichoderma spp. associé à Glomus spp. Rappelons que les Glomus spp. sont connus comme des champignons mycorhiziens, alors que les Gliocladium spp. et Trichoderma spp. sont des champignons filamenteux.

Nos résultats montrent que ces deux associations permettent de réduire le développement de P. parasitica dans le substrat. De plus, une corrélation est observée sur la sévérité des symptômes de C. ternata, avec moins de plantes exprimant la maladie (Figure 1).

Certaines associations ne sont pas bénéfiques

En revanche, on peut noter qu'une autre association de micro-organismes (le champignon Gliocladium spp. et la bactérie Bacillus spp.) semble avoir un effet négatif ! Elle a augmenté la sévérité des symptômes de C. ternata, notamment la mortalité, et le développement de P. parasitica dans le substrat (Figure 1).

Par ailleurs, aucun traitement à l'aide d'un BCA en solo n'a, dans cet effet, montré d'effet significatif sur le pathogène (Manasfi et al., Submitted). Le meilleur niveau d'inhibition du mathogène des traitements combinés montre l'avantage de cette stratégie, à condition de bien choisir les partenaires de l'association.

Ces résultats pourraient être complétés par des tests de protection par traitement combiné de trois, voire quatre micro-organismes.

Conclusion

Des micro-organismes pathogènes identifiés

Choisya ternata est une plante ornementale souvent touchée en pépinière par la pourriture racinaire provoquée notamment par des champignons du genre Phytophthora. Cette maladie peut induire des pertes allant jusqu'à 80 %, ce qui pousse les producteurs à l'usage intensif de produits phytopharmaceutiques de synthèse. Afin de limiter l'utilisation de ces produits, une meilleure connaissance des acteurs de la défense des plantes est nécessaire.

Les travaux de la thèse de Youssef Manasfi ont permis d'identifier des espèces du genre Phytophthora pathogènes de C. ternata, d'étudier des organismes acteurs de défense au niveau racinaire et de développer une approche de lutte alternative aux produits phytopharmaceutiques. L'identification des espèces de Phytophthora montre la présence majoritaire de P. parasitica dans la production de C. ternata en pépinière. Ils mettent aussi en évidence, pour la première fois en France et chez Choisya, la présence de P. tropicalis.

Tests de micro-organismes bénéfiques

La stratégie utilisant des micro-organismes bénéfiques du sol dans le but de limiter le développement de pathogènes et de stimuler les défenses de la plante a été ciblée. Ces micro-organismes nommés agents de contrôle biologique (BCA) font partie des moyens de lutte biologique parfois utilisés en horticulture.

Des traitements de Choisya ternata par différents BCA ont été évalués par suivi du développement de Phytophthora parasitica dans le substrat grâce au développement de la PCR quantitative en temps réel (qPCR), associé au suivi des symptômes sur les végétaux.

Dans les conditions de cette évaluation, sur cette espèce végétale et contre cette espèce de pathogène, les traitements combinant Glomus spp. et Gliocladium spp., ou bien Glomus spp. et Trichoderma spp. ont assuré la meilleure protection contre Phytopthora parasitica.

CONTACTS : marc-antoine.cannesan@astredhor.fryoussef.manasfi@gmail.comWassila.riah-anglet@unilasalle.frmelanie.bressan@unilasalle.frmaite.vicre@univ-rouen.frisabelle.gattin@unilasalle.frLIEN UTILE : www.astredhor.frBIBLIOGRAPHIE : - Manasfy Y., 2018, Lutte contre les pathogènes telluriques en contexte horticole : cas du pathosystème Choisya ternata/Phytophthora spp. Thèse préparée au sein de l'université de Rouen Normandie (sous presse).