Lutte génétique et santé végétale : l'exemple des céréales

La lutte génétique est un levier de protection des cultures, notamment de blé. Quels sont ses possibilités, ses innovations et les moyens d'assurer sa durabilité ?

Avec une surface agricole utile de 29 millions d'hectares et une production de plus de 70 milliards d'euros par an, la France est la première puissance agricole européenne.

À elles seules, les céréales représentent près de 9,5 millions d'hectares de culture et 67 millions de tonnes produites par an, dont plus de 5 millions d'hectares et en moyenne 38 millions de tonnes pour le blé tendre.

Résistance naturelle des plantes : de quoi s'agit-il ?

Les enjeux des maladies des plantes

Chaque année, les cultures de céréales sont soumises à de fortes pressions parasitaires, entraînant des pertes de rendement et de qualité variables en fonction des maladies (Singh et al., 2016). Les moyens de lutte contre ces maladies sont multiples, mais une protection intégrée faisant appel à des leviers agronomiques, à l'utilisation de pesticides, au biocontrôle mais également à l'innovation variétale est recommandée pour une lutte efficace et durable.

Pour les espèces de grande culture, les pesticides représentent, encore aujourd'hui, l'un des principaux moyens de lutte. En Europe, chaque année, plus d'un milliard d'euros sont consacrés à l'utilisation de fongicides pour combattre uniquement la septoriose, l'une des principales maladies foliaires du blé (Fones et Gurr, 2015).

En 2008, le premier plan Écophyto a été lancé avec comme but de réduire progressivement l'utilisation des produits phytosanitaires, tout en maintenant les performances économiques. Dans ce cadre, l'innovation variétale et l'utilisation des résistances naturelles des plantes représentent une des voies majeures pour réaliser cette transition.

Résistance naturelle : du système à deux voies à celui à neuf mécanismes

Au cours de leur évolution, les plantes ont mis en place un arsenal sophistiqué de mécanismes de défense contre les bioagresseurs. Ce système « immunitaire » a initialement été décrit comme un modèle à deux composantes (Jones et Dangl, 2006).

Une première voie de défense, nommée PTI (pathogen-associated molecular pattern triggered immunity), repose sur la reconnaissance de molécules très conservées chez les bioagresseurs (à l'exemple de la flagelline et de la chitine).

La seconde voie, dite ETI (effector-triggered immunity), est à l'origine d'une réponse plus forte qui se termine généralement par le déclenchement d'un processus de mort cellulaire, appelé HR (hypersensitive response). Cette voie se met en place après la reconnaissance directe ou indirecte de molécules spécifiques à chaque bioagresseur, et dans la majorité des cas, à un ou des éliciteurs spécifiques de certaines souches d'un même bioagresseur.

Ce modèle est cependant remis en question par l'accumulation de nouvelles données. En particulier, la multiplication, ces dernières années, du nombre de gènes de résistance aux maladies clonés a conduit à une classification en neuf mécanismes de défense. Cette classification est basée sur le type d'interaction entre hôtes et agresseurs, le compartiment cellulaire mis en jeu, et le type de protéines impliquées (Kourelis et van der Hoorn, 2018).

Ces mécanismes sont contrôlés par des gènes de la plante-hôte, dont la plupart appartiennent à la grande famille des NBS-LRR (nucleotide binding site leucine rich repeat) ainsi qu'à celle des RLK (receptor like kinase).

Résistances qualitative et quantitative

La résistance aux agents pathogènes est également subdivisée en résistance qualitative et résistance quantitative ou partielle. D'un point de vue phénotypique, la résistance qualitative se traduit par une résistance totale, alors que la résistance quantitative, incomplète, permet à l'agent pathogène de se reproduire mais en moindres proportions que dans un contexte de sensibilité.

Les termes résistances qualitatives et quantitatives peuvent également qualifier le déterminisme génétique de ces résistances. Une résistance qualitative est ainsi contrôlée par un gène unique, dit gène majeur, alors qu'une résistance quantitative est oligo- ou polygénique. Ainsi, quatre catégories de résistance peuvent être décrites suivant le contexte phénotypique et génétique, et la nature qualitative et quantitative des résistances (Niks et al., 2015). Les résistances les plus étudiées sont de nature qualitative - en d'autres termes contrôlées par un gène majeur conférant une résistance totale.

La diversité de ces mécanismes et modes d'action, la multiplicité des gènes et QTL de résistance représente un potentiel extraordinaire pour la construction de variétés génétiquement résistantes.

Comment les hommes utilisent cette résistance

Très ancienne pratique empirique

Ces résistances génétiques sont utilisées et sélectionnées par l'homme depuis la domestication des plantes. Au début de l'agriculture, cette sélection s'est faite de façon empirique et inconsciente, dans l'ignorance du déterminisme génétique, sur la base d'observations visuelles au champ.

Cette stratégie a conduit principalement à sélectionner des résistances phénotypiques qualitatives. Le gène de résistance à la septoriose Stb6 est ainsi retrouvé avec des fréquences importantes dans les premières espèces de blé dur domestiquées (Saintenac et al., 2018), suggérant une sélection par les premiers agriculteurs dans le bassin de domestication du blé dur.

Alors que les résistances qualitatives sont faciles à phénotyper et à sélectionner, elles sont en général rapidement contournées par l'agent pathogène. De nombreux exemples de contournement ont ainsi été répertoriés (Ellis et al., 2014 ; McDonald et Mundt, 2016). Cette situation a contraint les sélectionneurs à chercher des solutions alternatives à l'utilisation seule des résistances qualitatives. Ainsi, la recherche et la sélection de résistances plus durables, en d'autres termes de résistances efficaces sur un grand nombre d'années une fois déployées sur de larges surfaces, sont devenues une priorité pour toute la filière.

Le quantitatif pour la durabilité

Une des solutions repose sur l'utilisation de résistances quantitatives gouvernées par un ou plusieurs gènes ou QTL à effets mineurs, qui sont estimées plus durables (Niks et al., 2015). Par exemple, le gène Lr34 qui confère une résistance partielle à la rouille brune a été introduit dans les variétés de blé cultivées il y a maintenant plus de cinquante ans (Krattinger et al., 2009). De même, le QTL Fhb1, qui entraîne une résistance quantitative contre la fusariose de l'épi, a été sélectionné dans les variétés chinoises à la suite de croisements avec des variétés locales de pays (Rawat et al., 2016).

La sélection intensive de ces différents types de résistance dans les variétés de blé actuelles a conduit à une augmentation de la résistance moyenne envers les maladies. La note moyenne de résistance à la septoriose a ainsi augmenté d'un point (sur une échelle de 1 à 9) sur les dix dernières années chez les variétés de blé tendre inscrites au catalogue national en France. Ceci se manifeste par une diminution de l'écart des rendements entre conduites traitées et non traitées aux fongicides (Arvalis).

Améliorer le phénotypage

Améliorer la résistance des variétés de demain aux maladies repose sur une amélioration des méthodologies de sélection et de phénotypage, une caractérisation fine du déterminisme génétique associé à ces résistances et sur le clonage de nouveaux gènes de résistance.

Les nouvelles méthodologies de sélection, et notamment la sélection assistée par marqueurs et plus récemment la sélection génomique, ont favorisé l'utilisation des résistances mono- et polygéniques et ainsi la création et le déployement de nouvelles variétés résistantes (Crossa et al., 2017 ; Goutam et al., 2015).

L'amélioration des outils et méthodologies de phénotypage constitue un des piliers de l'amélioration variétale. Il représente une étape essentielle à la détermination des facteurs génétiques contrôlant les résistances. Les études de génétique et les programmes de sélection sont encore largement basés sur des évaluations visuelles, ce qui limite la détection fine des gènes à effet quantitatif. Le développement d'outils de phénotypage basés sur l'imagerie est en plein essor, ouvrant la voie à des technologies plus rapides, plus précises et mieux prédictives.

En collaboration avec différents partenaires, nous avons récemment comparé et développé un ensemble de méthodologies complémentaires (allant de l'observation visuelle à l'analyse d'images multispectrale) pour évaluer les symptômes sur grains liés à la fusariose de l'épi. Nous avons montré que l'utilisation de ces nouvelles méthodologies rend possible une analyse plus précise des bases génétiques de la résistance du blé à l'infection des grains.

Cloner des gènes R pour caractériser les mécanismes de résistances

Le clonage de gènes de résistance (gènes R), en d'autres termes l'identification de la séquence d'ADN responsable de la résistance à une maladie, est une étape clé dans la course à l'amélioration variétale.

Le clonage des gènes R permet notamment de définir des marqueurs moléculaires diagnostics permettant une détermination fiable et précise de la présence du gène R chez une variété donnée. De tels marqueurs peuvent ainsi être utilisés pour réaliser une sélection rapide dès les premiers stades de développement de la plante, évitant une étape de phénotypage souvent complexe et coûteuse.

Le clonage des gènes R et l'identification de leur fonction représentent également une étape nécessaire à la compréhension de leur mode de fonctionnement, l'étude de leur interaction avec un ou des éliciteurs plus ou moins spécifiques produits par l'agent pathogène, et de façon générale, la caractérisation des mécanismes et processus biologiques impliqués dans la résistance médiée par ces gènes. Ces informations paraissent aujourd'hui indispensables pour une utilisation raisonnée et efficace des gènes R.

L'exemple du blé

Nombreux gènes identifiés, peu de marqueurs disponibles

Concernant le blé, plusieurs centaines de gènes de résistance aux maladies ont été cartographiés (Brown et al., 2015 ; Buerstmayr et al., 2009 ; Ellis et al., 2014 ; Faris et al., 2013 ; Oliver et al., 2012), mais très peu de marqueurs diagnostics utilisables facilement et fiables en sélection sont aujourd'hui disponibles (Keller et al., 2018).

Plusieurs laboratoires internationaux se sont lancés dans des stratégies visant au clonage de gènes R. Alors que le premier gène de résistance à une maladie à été isolé en 1992 chez le maïs, les premiers gènes chez le blé (Lr10 et Lr21) conférant une résistance à la rouille brune ont été clonés seulement onze ans plus tard, en 2003 (Feuillet et al., 2003 ; Huang et al., 2003).

La stratégie, encore aujourd'hui la plus fréquemment utilisée pour cloner des gènes R, est celle du clonage positionnel. C'est une stratégie longue et lourde à mettre en place, avec un résultat incertain. Elle repose sur une première étape de cartographie génétique, basée sur l'étude d'une population d'individus issue du croisement entre une variété résistante, possédant le gène de résistance considéré, et une variété dite sensible, qui en est dépourvue. Le déploiement de cette stratégie a été confronté à plusieurs verrous, comme l'absence de séquence de référence ou de recombinaison dans la région d'intérêt, qui ont par le passé freiné, voire stoppé le clonage de certains gènes R.

Le séquençage du génome du blé, une avancée majeure

Cependant, ces dernières années, les technologies, outils et ressources nécessaires au clonage ont connu un essor spectaculaire. Les nouvelles technologies de séquençage haut débit (NGS), aux prix en constante diminution et aux capacités en augmentation rapide, associées à de nouvelles méthodologies d'assemblage, ont permis à l'International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) d'obtenir la première séquence de référence du génome du blé tendre (The International Wheat Genome Sequencing Consortium [IWGSC] et al., 2018).

Cette séquence de référence représente une avancée majeure dans la compréhension de la structure fine du génome complexe du blé tendre. Elle ouvre la voie à l'étude des relations structure/fonction, et offre une formidable ressource pour toute la communauté scientifique travaillant sur le blé, et plus largement sur les céréales.

De plus, le séquençage de plusieurs autres variétés mais aussi d'espèces apparentées, l'accès facilité à des ressources comme les banques BAC, les populations de mutants et l'amélioration de technologies de génotypage haut débit plus flexibles et moins coûteuses accélèrent considérablement l'identification de gènes d'intérêt par le clonage positionnel.

Approche TACCA

En parallèle, ces développements technologiques et méthodologiques ont également favorisé l'émergence de stratégies révolutionnaires de clonage de gènes impliqués dans le contrôle de résistances quantitatives, plus rapides et moins coûteuses.

Par exemple, l'approche nommée TACCA (targeted chromosome-based cloning via long-range assembly) repose sur l'utilisation d'une nouvelle méthodologie de séquençage permettant d'obtenir une séquence de très haute qualité de la région portant le gène de résistance chez le parent résistant en seulement quatre mois (Thind et al., 2017). Cette approche a ainsi permis d'isoler le gène de résistance à la rouille brune Lr22a chez le blé.

MutRenSeq et MutChromSeq

Récemment, une équipe du John Innes Centre (JIC) a développé avec succès l'approche MutRenSeq (Steuernagel et al., 2016) pour le clonage de gènes R supposés appartenir à la famille des NBS-LRR.

Cette approche de type « gènes candidats » est basée sur une hypothèse forte associant le gène R à cloner à une famille de gènes connue. Une population de lignées mutantes est créée par traitement de graines de la variété résistante par un agent chimique (EMS) induisant plusieurs milliers de mutations ponctuelles dans le génome de chaque individu. Les lignées mutantes sont ensuite phénotypées dans l'objectif d'identifier des individus sensibles résultant potentiellement d'une mutation dans le gène R ciblé. En parallèle, l'ensemble des gènes de type NBS-LRR sont capturés à l'aide d'amorces spécifiques chez la variété résistante ainsi que les différentes lignées mutantes sensibles identifiées précédemment, puis séquencés. La copie portant une mutation chez tous ces individus sensibles correspond au gène R ciblé.

Si des doutes subsitent quand à la nature du gène ciblé, une alternative à l'approche MutRenSeq, nommée MutChromSeq, repose sur le séquençage de la totalité du chromosome portant le gène R ciblé et la recherche d'un gène muté chez tous les individus sensibles identifiés (Sánchez-Martín et al., 2016).

Trois gènes de résistance ont déjà été clonés en quelques mois en utilisant ces deux approches (Sánchez-Martín et al., 2016 ; Steuernagel et al., 2016).

Approche AgRenSeq...

Ces deux dernières approches nécessitent l'existence d'un gène unique majeur de résistance chez la variété étudiée. Pour pallier cette limitation, l'approche AgRenSeq a été récemment développée. Elle repose sur une analyse de génétique d'association utilisant les données de capture/séquençage des gènes de type NBS-LRR comme marqueurs moléculaires. Cela a permis de cloner quatre gènes de résistance à la rouille chez le blé en moins de six mois (Arora et al., 2018).

De plus en plus de gènes clonés

À ce jour, vingt-six gènes de résistance à diverses maladies ont été clonés chez le blé avec une accélération ces dernières années, et plusieurs dizaines sont en cours (Keller et al., 2018 ; Marchal et al., 2018).

Par exemple, dans le cadre d'une collaboration avec l'équipe de K. Kanyuka (Rothamsted Research, UK) et via l'utilisation combinée des ressources et outils de génomique, nous avons cloné le premier gène de résistance à la septoriose (Stb6), l'une des maladies foliaires les plus dévastatrices pour la culture de blé en Europe (Saintenac et al., 2018). Stb6 code une protéine appartenant à la famille des WAK (wall associated kinase). Le séquençage de ce gène chez 98 variétés de blé a permis d'identifier différents allèles et de définir des marqueurs diagnostics, à la disposition de la filière céréalière pour suivre ce gène dans les différentes variétés.

Quelles perspectives ?

Une sélection plus efficace, à orienter vers les résistances quantitatives

Les plantes ont développé un arsenal de mécanismes de résistance diversifiés et complémentaires. Grâce à l'essor de la génomique, nous avons assisté à une augmentation exponentielle du nombre de gènes clonés contrôlant ces résistances. Nous pouvons légitimement penser que, d'ici quelques années, plusieurs dizaines de gènes de résistance à différentes maladies seront identifiés et pourront être utilisés en sélection.

Dans un futur proche, ceci va se traduire par le développement probable de puces de génotypage dédiées aux gènes de résistance permettant une sélection plus efficace.

La plupart des programmes de clonage de gènes de résistance ont concerné jusqu'à ce jour principalement des gènes majeurs. Dans un double objectif de diversification des sources de résistance et d'une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiologiques mis en jeu chez les plantes pour contrôler leurs pathogènes, un effort conséquent doit être consenti pour l'identification des gènes et fonctions impliqués dans des résistances quantitatives, données pour être plus durables. Le développement d'outils de phénotypage fin doit permettre de surmonter les difficultés inhérentes à l'étude de ces résistances.

Mieux comprendre les mécanismes

De même, on assiste au développement de projets de recherche visant à caractériser, chez différentes espèces végétales et différentes maladies, des facteurs de sensibilité ou des suppresseurs de résistance jouant un rôle important dans le contrôle génétique des maladies. Tout ceci devrait nous permettre d'avoir une vision plus intégrative des mécanismes de défense et résistance existant chez une plante cultivée comme le blé, et concourir à diversifier l'arsenal de gènes de résistance potentiellement utilisables en sélection.

De plus, une connaissance plus complète des mécanismes contrôlés par ces gènes, et de leur impact sur le développement des agents pathogènes in planta, ouvre la voie à des combinaisons de gènes potentiellement plus durables. De même, il devient urgent de comprendre comment ces gènes interagissent et d'étudier leur synergie ou leur antagonisme de façon à les combiner efficacement (Mundt, 2018).

Associer la résistance génétique avec d'autres leviers

S'il est clair que la lutte génétique a de beaux jours devant elle et que sa part dans les stratégies de lutte contre les bioagresseurs va croître ces prochaines années, il est illusoire d'imaginer que seule, elle suffira à obtenir un contrôle durable des bioagresseurs.

Il faut aujourd'hui raisonner l'utilisation de nos gènes de résistance en association avec d'autres leviers dans des stratégies de lutte : réfléchir au déploiement de ces gènes à l'échelle des territoires ou des paysages, mieux intégrer les connaissances sur l'évolution des pathogènes et leur épidémiologie, analyser les interactions positives ou négatives de ces résistances avec d'autres stress, en particulier abiotiques. En un mot, rompre avec la fâcheuse habitude de les utiliser seuls, avec comme conséquence leur contournement plus ou moins rapide.