Des outils pour évaluer les effets de biostimulants sur le végétal

Dans le cadre du LabCom Estim, des méthodes et des outils ont été développés pour évaluer les biostimulants dans des conditions de stress abiotiques maîtrisés.

Le règlement harmonisé européen 2019/1009 intègre, depuis juin 2019, les biostimulants dans la grande famille réglementaire des MFSC (Matières fertilisantes et supports de culture). Ils sont définis comme des produits qui stimulent les processus de nutrition des végétaux. Des premières certifications européennes devraient voir le jour d'ici quelques années. Afin de pouvoir mieux identifier et caractériser ces produits, le laboratoire mixte de recherche LabCom Estim développe depuis 2016 des technologies d'évaluation multicritères de l'activité de biostimulants sur la tomate.

De l'usage des biostimulants à leur évaluation

Un levier pour la santé des cultures

Les contraintes environnementales d'une culture ont un impact sur la productivité agricole. Notamment les situations de déficit hydrique, les températures, trop froides ou trop chaudes, influent sur le développement de maladies et perturbent le développement et la croissance de la plante qui doit sans cesse adapter son métabolisme et l'allocation des flux de carbone en fonction de sa capacité photosynthétique du moment. Malgré ces aléas, l'usage de produits phytosanitaires et engrais chimiques a, jusqu'à présent, permis de préserver et d'optimiser les rendements. Aujourd'hui les nouvelles contraintes liées au réchauffement climatique et la volonté d'aller vers des pratiques agronomiques durables et soucieuses de la santé du consommateur, font de l'usage des biostimulants une alternative attractive pour la profession (agrofournisseurs et semenciers) et mobilise de plus en plus la communauté scientifique.

Une évaluation nécessaire mais complexe

Il s'avère que l'activité des biostimulants, dont les effets recherchés sont de renforcer les aptitudes de la plante à se développer (germination, croissance, fructification, rendement) sous des contraintes de température, de lumière ou hydriques fluctuantes en conditions de production, est souvent peu reproductible et difficile à évaluer. De plus, les biostimulants sont souvent constitués de mélanges d'actifs avec des synergies complexes à identifier. Pourtant, évaluer l'activité de ces nouveaux intrants est indispensable pour anticiper la règlementation à venir (voir article p. 40 et Encadré 1 ci-dessous), pour optimiser leurs conditions d'application et permettre leur meilleure intégration dans les systèmes de culture. Cette problématique a motivé le projet de création d'un laboratoire mixte de recherche, le LabCom Estim soutenu dans sa phase de construction de 2016 à 2019 par l'Agence nationale de la recherche (ANR), pour développer des technologies d'évaluation multicritères de l'activité de biostimulants sur la tomate. Aujourd'hui, certains de ces outils sont mobilisables pour caractériser leurs effets.

Reproductibilité des stress, imagerie et biosenseurs

L'association de l'organisme Arexhor Pays de la Loire (station de l'institut technique horticole Astredhor) avec les équipes Arch-E, Emersys, Fungisem, Respom de l'Institut de recherche en horticulture et semences (IRHS, Unité mixte de recherche université d'Angers, Inrae Institut Agro) a permis de développer des méthodes et des outils pour évaluer les biostimulants dans des conditions de stress abiotiques maîtrisées.

Pour standardiser les essais d'application de biostimulants au champ, des systèmes de culture permettant de contrôler l'application d'un stress et sa reproductibilité ont été mis au point dans les conditions de production. La mesure d'effets biostimulants sur les caractères agronomiques a été rationalisée par des méthodes d'imagerie. Ainsi des principes actifs ont pu être identifiés et utilisés comme référence pour valider l'utilisation en laboratoire de plantes modèles biosenseurs(1) et l'activité de ces produits, et ainsi caractériser leur mécanisme d'action potentiel. Ces précribles de laboratoire permettent de réduire le nombre de modalités au champ, d'identifier de nouveaux produits, d'optimiser leur protocole d'application, et d'illustrer leurs effets sur les orientations métaboliques de la plante en lien avec sa croissance et son développement.

Évaluation agronomique en conditions de production

Création d'un dispositif d'évaluation sur plants de tomate

Dans le but de valider les outils de laboratoire en cours d'élaboration, la station Arexhor Pays de la Loire a eu pour mission la conception et la réalisation d'un dispositif permettant d'évaluer agronomiquement l'effet de biostimulants sur des jeunes plants de tomate placés dans différentes conditions de stress abiotique. La tomate a été choisie comme modèle, car les objectifs de biostimulation diffèrent en fonction des filières (plants potagers ou maraîchage).

La première étape a été d'identifier des conditions stressantes problématiques pour les filières végétales. Ainsi, nous avons sélectionné cinq conditions de stress abiotique : le manque d'eau, le manque de lumière, le manque ou l'excès de nutriments, l'excès de sel.

L'étape suivante a été de mettre en oeuvre ces stress et de concevoir un dispositif simple permettant leur pilotage. L'objectif étant de maîtriser les stress pour l'obtention d'effets agronomiques caractérisables par des outils de mesure actuellement à notre disposition. Plusieurs critères d'évaluation ont été définis :

- développement des plantes (règle graduée) ;

- indice chlorophyllien (appareil SPAD 502) (voir photo p. 43) ;

- morphologie des feuilles (outil d'imagerie) ;

- biomasse fraîche et sèche d'organes cibles (balance).

La finalité de ce dispositif étant la réalisation en routine d'essais d'évaluation de biostimulants, Arexhor Pays de la Loire a cherché à optimiser le plus possible le système pour proposer un service efficace et peu coûteux. Ainsi, un dispositif de production autonome, en subirrigation, a été développé, permettant de tester un biostimulant en moins d'un mois, dans plusieurs conditions stressantes. Les effets sont mesurables à des stades précoces et validés sur plusieurs répétitions. Les avantages de ce système sont sa facilité de mise en oeuvre et de pilotage, ainsi que sa modularité, qui donne l'opportunité de répondre de façon optimale aux besoins des agrofournisseurs.

Validation du dispositif par des tests de produits

Le dispositif mis au point a été éprouvé par l'évaluation de produits d'origines diverses revendiquant un effet biostimulant et disposant déjà, pour la plupart, d'une autorisation de mise sur le marché (AMM MFSC). Des produits à base d'algues, d'acides aminés ou encore de micro-organismes ont ainsi été testés.

Ces tests ont permis de constater qu'il était primordial d'évaluer des produits en conditions non stressantes et stressantes. En effet, un produit peut ne pas avoir d'effet en conditions dites « optimales », voire même avoir un effet dépressif sur des paramètres agronomiques, et pourtant se révéler être un très bon biostimulant en conditions stressantes.

La plus-value des outils d'imagerie : l'acquisition automatique de données

Dans le cadre de nos essais, les mesures agronomiques sont généralement réalisées manuellement. Ces mesures peuvent être dans certains cas très chronophages, comme pour les mesures de croissance, et nécessitent la manipulation des plantes, ce qui peut être perçu pour elles comme un stress. À l'aide des chercheurs du Laboratoire angevin de recherche en ingénierie des systèmes (Laris), nous avons pu mettre au point un système de mesure en continu de la croissance des plantes (hauteur). Ce dispositif repose sur l'utilisation de Lidar (Light Detection And Ranging), outil utilisé dans l'aéronautique et l'automobile qui mesure avec une très grande précision les distances à l'aide de lasers.

Ce matériel d'imagerie automatise l'acquisition de données de croissance (hauteur) et permet de les visualiser in fine sous la forme de graphiques et de vidéos (films illustrant la croissance, le développement et les mouvements des plantes) (Figure 1). Par ce système, nous accédons également à d'autres informations telles que le rythme circadien des plantes, ou encore les mouvements ondulatoires des feuilles. Il constitue une réelle plus-value d'un point de vue technique mais aussi commercial, les agrofournisseurs appréciant tout élément illustrant concrètement les résultats.

Le précriblage des produits stimulants en laboratoire

Caractériser les effets physiologiques des biostimulants au niveau moléculaire

L'utilisation de plantes biosenseurs pour évaluer l'activité des produits et optimiser les méthodes d'application en amont des essais au champ constitue une étape stratégique de précriblage en laboratoire. Les modalités d'essai aux champs pour évaluer l'activité de biostimulants sont longues et coûteuses. Disposer d'outils de précriblage de laboratoire vise à réduire le nombre de produits testés et à optimiser les modes d'application pour la culture.

Des lignées biosenseurs de la réponse de la plante à ces produits ont été mises au point sur des modèles de laboratoire dans le but d'optimiser les modalités d'application sur plants de tomate en conditions de production. Ils permettent également de cibler des nouveaux produits actifs candidats, et d'illustrer leur mécanisme d'action sur la plante à des niveaux tissulaire, cellulaire et moléculaire.

Pour caractériser ces effets stimulants, les biosenseurs ont été développés sur des plantes modèles permettant en condition de laboratoire, une analyse in planta, essentiellement chez Arabidopsis, ou en système cellulaire sur cals de rosier ou d'Arabidopsis. L'intérêt d'utilisation de biosenseurs chez le modèle Arabidopsis a été précédemment illustré par Saint-Macary et al. (2017) pour les voies de défense de l'acide salicylique. Dans notre cas, les séquences régulatrices(2) ou promoteurs de gènes marqueurs utilisés pour la construction de biosenseurs (voir Encadré 2) ont été choisis à partir de méta-analyses de bases de données de transcriptomique(3) et de la littérature. Les marqueurs sélectionnés permettent de suivre différents mécanismes impliqués dans la réponse de la plante aux stress, et dans son métabolisme de croissance et de morphogenèse (voir tableau p. 47). Lors de cette analyse, nous nous sommes assurés que l'activation au niveau ARN de ces marqueurs présentait une bonne corrélation avec la réponse de la plante.

Sélection de lignées biosenseurs

Des lignées rapportrices(4) de l'activité de gènes marqueurs ont été sélectionnées après transformation génétique avec les constructions moléculaires permettant de faire exprimer un gène rapporteur (GUS et GFP) sous le contrôle des promoteurs (p) respectifs de ces gènes marqueurs (Encadré 2). Les différentes lignées dites biosenseurs permettent de suivre et de quantifier l'activité du gène rapporteur (et donc du promoteur auquel il a été associé) induite par le biostimulant. Celle-ci rapporte donc l'activité du gène marqueur spécifique d'un type de réponse de la plante. Des lignées biosenseurs ont été développées pour caractériser les différents types de réponse de la plante et sont décrites dans le tableau.

Mise au point du criblage de produits biostimulants

Pour disposer de tests fiables et valider ces conditions de criblage, il est nécessaire d'établir des conditions physiologiques reproductibles (stade de la plante, support de culture, température, lumière, etc.) et de disposer de produits de référence dont l'activité stimulante a été vérifiée sur « tomate » en système de culture.

Dans le système de criblage in planta sur le modèle Arabidopsis (Encadré 2), les semences des différentes lignées biosenseurs sont conservées dans une banque de semences pour en disposer à façon. Les procédures d'utilisation des biosenseurs ont été mises au point à l'aide de produits dont les effets sur l'activation de gènes marqueurs étaient déjà connus. Puisque nous ne disposions pas de biostimulants de référence, nous avons calibré les tests à l'aide du Bion (analogue de l'acide salicylique), du méthyl-jasmonate et de la flagelline 22, connus pour leurs effets sur les réponses de défense. L'utilisation des lignées biosenseurs exprimant les constructions pPR1::GUS et pLOX::GUS, marqueurs respectifs des deux principales voies de défense de la plante, la voie de l'acide salicylique et la voie de l'acide jasmonique, a permis d'identifier des stades génériques de la plantule propices au suivi de l'activité des biosenseurs.

Sur la base de colorations histochimiques de l'activité beta-glucuronidase du gène rapporteur GUS (Encadré 2) l'analyse deux jours après le traitement sur des jeunes plantules d'Arabidopsis de quatorze jours s'est montrée optimale (Figure 2). Ce protocole a été validé pour la découverte d'activité de biocontrôle de la septoriose du blé par des souches de Trichoderma et de Pseudomonas (Barakat et al., 2019 ; Barakat et al., 2020).

Le protocole ainsi établi a été étendu à l'ensemble des lignées biosenseurs et permet de réaliser des tests de routine pour étudier de nouveaux biostimulants notamment impliqués dans la réponse aux stress abiotiques.

L'utilisation des biosenseurs en système cellulaires, à partir de cals chez Arabidopsis ou chez Rosa hybrida permet d'obtenir des résultats plus rapidement. Dans ce cas, la production de cals in vitro de ces lignées rapportrices est maintenue et utilisable à façon pour les analyses.

Développement d'un marqueur spécifique du métabolisme de croissance de la plante

La construction du promoteur du gène Branched1 (BRC1) fusionné au gène rapporteur GFP(5) (pBRC1::GFP) a été introduite chez Rosa wichuraiana pour étudier le rôle répresseur de BRC1 dans le démarrage de la croissance du bourgeon latéral (Encadré 3). L'inhibition de l'activité du promoteur BRC1 est attendue en 48 heures lorsque les cals sont traités par des produits stimulant la croissance. La fluorescence émise par l'expression de la GFP est mesurée, normalisée et les résultats soumis à des analyses statistiques (test de Kruskal-Wallis et test de Tuckey).

Des tests en conditions de production (voir première partie) mettent en évidence que le Bion, connu pour ses propriétés d'éliciteur (produit phytopharmaceutique de biocontrôle, stimulateur de défense des plantes), s'avère avoir aussi un effet biostimulant sur la croissance. Les méthodes utilisées en systèmes cellulaires ont permis de confirmer l'effet activateur du Bion sur la croissance. Cet effet biostimulant a été observé en quantifiant l'émission de fluorescence de la GFP sous le contrôle du promoteur BRC1 dans les cals de rosier.

L'ensemble de ces analyses confirment l'efficacité d'utilisation des biosenseurs au laboratoire pour caractériser rapidement des propriétés biostimulantes et anticiper les choix d'expérimentations agronomiques dans les conditions de la culture. En particulier, l'utilisation du promoteur BRC1 pour le précriblage de biostimulants va assurément faciliter et réduire les coûts des pratiques expérimentales destinées à la mise au point de nouveaux intrants pour les cultures.

Des outils d'évaluation pour qui ?

Pour les producteurs de biostimulants, le système cellulaire « cals » constitue un outil particulièrement rapide pour évaluer l'intérêt de leurs produits et identifier les mécanismes potentiels impliqués dans la réponse de la plante. L'objectif est d'avoir sur le marché des produits davantage caractérisés pour une meilleure utilisation dans la culture. Il sera possible à terme de caractériser des effets de biostimulants sur la résistance au stress hydrique, pour maîtriser l'allongement des entre-noeuds, ou pour réduire la sénescence foliaire, etc. Ces différentes réponses de la plante sont gouvernées par des voies hormonales universelles au règne végétal, respectivement l'acide abscissique, les gibbérellines et les cytokinines dans les exemples précités. Ces mécanismes assez bien conservés devraient permettre de transférer cette technologie directement chez la tomate.

Ces outils sont prioritairement développés pour les agrofournisseurs et les conseillers, qui veulent faire du criblage de substances, caractériser des doses applicables, définir des protocoles d'utilisation, valider des efficacités.

(1) Un biosenseur est un système biologique qui permet de suivre des changements métaboliques à l'intérieur d'une cellule, d'un tissu ou d'un organisme. Ces changements sont caractérisés par une méthode de révélation et d'analyse d'un signal associé (coloration histochimique, émission de fluorescence).(2) Une séquence régulatrice de la transcription peut moduler le niveau d'expression du gène via l'efficacité de son promoteur. Le promoteur est l'élément indispensable à l'initiation de la transcription d'un gène. On le trouve en amont de tous les gènes exprimés. Ainsi, l'activation d'un promoteur reflète un certain niveau d'activation d'un gène. La construction biosenseur (voir Encadré 2) permet de visualiser facilement cette activité dans les tissus de la plante en suivant l'expression d'un gène rapporteur sous le contrôle de ce promoteur.(3) La transcriptomique est une approche de génétique moléculaire qui permet de caractériser l'expression au niveau ARN de l'ensemble des gènes d'un génome. Ainsi, il est possible de comparer un niveau d'activité des gènes dans des conditions physiologiques données (différents tissus, stades de développement, effets du milieu).(4) Une lignée rapportrice est une lignée transgénique qui exprime un transgène codant pour une protéine détectable in situ et dans le cas présent permet d'évaluer l'activité du promoteur auquel elle est associée.(5) La GFP ou « Green Fluorescent Protein » est une protéine dont la séquence codante a été isolée chez la méduse Aequorea victoria et dont la propriété d'émission de fluorescence par une longueur d'onde excitation à 475 nm. Cette propriété autocatalytique de fluorescence est très utilisée pour ses propriétés rapportrices permettant de suivre l'activité des produits d'expression des gènes dans les cellules vivantes. Sa découverte et son utilisation en génétique moléculaire ont valu le prix Nobel de chimie à O. Shimomura en 2008.