Résistances aux phytos : le diagnostic passe au haut débit

L'application des techniques de séquençage à haut débit (SHD) au diagnostic permet désormais une recherche intensive des résistances. Démonstration avec l'ambroisie.

Diagnostiquer rapidement la présence de plantes résistantes dans une parcelle est indispensable pour une gestion optimale de l'emploi des produits phytosanitaires. L'emploi des techniques de séquençage d'ADN dites « à haut débit » rend désormais possible l'analyse rapide d'un très grand nombre de plantes et la détection avec une haute précision de mutations en cause dans la résistance. En 2018, la preuve de concept de cette technique a été faite sur la recherche de résistance aux herbicides inhibiteurs de l'ALS (groupe HRAC B(1)) chez l'ambroisie à feuilles d'armoise.

Diagnostiquer les résistances pour gérer les phytos

Les tests ADN « classiques » : une capacité d'analyse limitée

Le diagnostic rapide et précis des résistances aux produits phyto est essentiel pour préserver l'efficacité du contrôle chimique dans la durée (R4P, 2020). Les tests « ADN », qui permettent de rechercher par PCR (voir encadré) des mutations en cause dans la résistance, sont les outils les plus rapides et les plus fiables pour le diagnostic des résistances liées à la cible des herbicides. Cependant, la recherche de résistances dans un grand nombre de plantes se heurte à deux obstacles : les capacités de traitement des laboratoires et le coût des analyses.

Séquençage à haut débit : le diagnostic massif à portée de main

Les techniques de séquençage à haut débit (SHD), aussi appelées « séquençage massivement parallèle » ou « séquençage de nouvelle génération », génèrent des dizaines de millions de séquences (voir encadré) par analyse. Elles permettent de séquencer en une seule fois l'ADN d'un grand nombre d'échantillons, et donc d'augmenter considérablement les capacités de diagnostic des tests « ADN ». Lorsqu'on effectue un prélèvement pour analyse sur une parcelle, on collecte un ensemble d'individus représentant la population d'un bioagresseur présente sur cette parcelle. Avec le séquençage « classique » de type Sanger, les analyses se font individu par individu. Pour analyser un échantillon prélevé sur une parcelle, on doit donc réaliser autant de séquençages qu'on a prélevé d'individus (Figure 1). Le SHD, lui, donne non seulement la possibilité de rechercher des mutations directement dans un ensemble d'individus (= dans une population), mais en plus celle d'analyser plusieurs dizaines de populations en une seule fois. Grâce à un système « d'étiquetage moléculaire », il est possible de trier les séquences et de les assigner à la population d'origine (Figure 1), ce qui permet d'obtenir, en sortie d'analyse, la fréquence de chacune des mutations recherchées dans chaque population. Cet outil donne donc potentiellement accès à un débit de criblage jamais atteint jusqu'alors pour le diagnostic de résistance aux produits phytosanitaires. Restait à apporter la preuve de son intérêt en l'utilisant pour étudier un cas concret.

Recherche de résistance chez l'ambroisie

Une adventice envahissante, allergisante, allergène... et résistante

L'ambroisie à feuilles d'armoise (Ambrosia artemisiifolia, photo 1, nommée ambroisie dans la suite du texte) est une « espèce dont la prolifération constitue une menace pour la santé humaine » (article D. 1338-1 du code de la santé humaine), en raison de son pollen très allergisant (rendant allergique) et allergène (induisant un symptôme d'allergie). Cette plante envahissante d'origine nord-américaine est présente en France, notamment dans le milieu agricole. Elle se développe particulièrement bien dans les cultures d'été comme le tournesol, le soja et le maïs (photos 2 à 4). Pour la combattre, les herbicides inhibiteurs de l'acétolactate-synthase (ALS, groupe HRAC B) sont le levier chimique le plus efficace, particulièrement en tournesol. Cependant, les inhibiteurs de l'ALS utilisables sur cette culture (à base d'imazamox ou de tribénuron) ne sont utilisables que sur les variétés rendues tolérantes aux herbicides dites « VrTH » (Clearfield et Clearfied Plus ou ExpressSun, respectivement). Mais l'utilisation mal raisonnée de ces substances a contribué à l'évolution de résistances chez l'ambroisie. Les premiers cas observés remontent à 2013 (Délye et al., 2015). Les tests biologiques de sensibilité aux herbicides sont longs et complexes chez l'ambroisie, à cause notamment de la maturité tardive et de la dormance des semences. De ce fait, cette espèce a été choisie pour effectuer la preuve de concept du diagnostic de résistances aux phytosanitaires par SHD.

Recherche de résistance liée à l'ALS : un échantillonnage sans précédent !

Des prélèvements ont été effectués sur 219 parcelles agricoles avec de fortes densités d'ambroisie à travers la France (Figure 2). Chaque prélèvement consistait en 50 feuilles, chacune prélevée sur une plante différente. C'est donc un total de 10 950 plantes qui ont été échantillonnées. L'ADN de ces échantillons a été extrait sur les mélanges de 50 feuilles (une extraction par lot de 50 feuilles), puis trois fragments du gène de l'ALS ont été amplifiés par PCR . Ces trois fragments portent tous les codons auxquels sont attendues des mutations pouvant conférer une résistance (Figure 3). Les échantillons ont ensuite été séquencés en utilisant la technologie Illumina, qui fait partie des techniques de SHD. Quinze codons de l'ALS ont été ciblés par nos analyses. Huit peuvent porter des mutations déjà connues pour conférer une résistance aux herbicides chez des adventices (Tranel et al., 2020). Sur les sept autres, des mutations conférant une résistance aux inhibiteurs de l'ALS en laboratoire ou chez d'autres organismes ont été décrites dans la littérature, mais n'ont pas été signalées à ce jour chez des adventices (Duggleby et al., 2008).

Calibrage de la méthode : le crash-test

Les analyses de SHD s'effectuent sur des lots de cinquante plantes dont l'ADN a été extrait en mélange. Pour vérifier que les fréquences de mutations détectées par SHD sont du même ordre de grandeur que celles qui seraient obtenues par séquençage de plantes individuelles, 31 échantillons « contrôlés » ont été analysés par SHD en même temps que ceux de terrain. Ces échantillons sont des lots de 50 plantes contenant chacun un nombre connu de plantes homozygotes ou hétérozygotes mutantes, de façon à obtenir une fréquence attendue de mutation allant de 0 % à 50 % selon l'échantillon. La corrélation entre les fréquences attendues dans les échantillons « contrôlés » et celles observées par SHD donne une mesure de la fiabilité de la méthode. Dans notre cas, le coefficient de corrélation linéaire est de 0,979 (Figure 4), ce qui est largement suffisant pour assurer la fiabilité de la méthode. En outre, aucun faux positif n'a été identifié. L'ambroisie étant diploïde, les cinquante plantes d'un échantillon contiennent chacune deux allèles de l'ALS, soit en tout cent allèles. Les résultats montrent qu'il est possible de détecter une plante hétérozygote mutante dans un lot de cinquante individus, soit un allèle mutant sur 100 : la détection de mutations par SHD est donc possible et fiable pour des mutations présentes à une fréquence aussi faible que 1 % dans les échantillons.

Cartographie des mutations détectées et perspectives

Cinq foyers de résistance liée à la cible identifiés

Cinq mutations, dont le rôle dans la résistance aux herbicides est établi, ont été détectées dans quinze des 219 prélèvements (Figure 2). Le foyer le plus important (douze prélèvements positifs) a été identifié en Occitanie, dans la zone d'où est originaire le premier cas signalé en France (Délye et al., 2015). Une mutation au codon 205 y est particulièrement présente et des mutations aux codons 197, 574 et 654 (Figure 3) y ont également été observées. La fréquence des mutations dans les populations étudiées varie de 1 % à 11,5 %. Un autre foyer est situé en Centre-Val de Loire : dans le Cher, des mutations aux codons 205 et 654 ont été détectées dans un prélèvement, avec une fréquence de 4 % et 1 % respectivement. Un troisième foyer est présent en Bourgogne-Franche-Comté, dans l'Yonne, où une mutation au codon 654 a été détectée dans un prélèvement avec une fréquence de 3 %. Un quatrième foyer provient d'Auvergne-Rhône-Alpes (en Ardèche), avec un prélèvement contenant une mutation au codon 197 (différente de celle d'Occitanie) à la fréquence de 2 %. Enfin, un cinquième foyer a été identifié en Nouvelle-Aquitaine, dans les Deux-Sèvres, avec trois prélèvements positifs où une mutation sur le codon 578 a été détectée avec une fréquence allant de 1,5 à 5 %. Il s'agit dans ce cas d'une mutation potentiellement impliquée dans la résistance, mais dont le rôle reste à démontrer chez une adventice.

Aucune mutation sur le gène de l'ALS n'a été détectée parmi les 204 prélèvements restants. Cela ne signifie pas pour autant qu'il n'y a pas de résistance liée à la cible dans les régions échantillonnées, mais simplement que nous n'en avons pas trouvé dans notre échantillonnage. Rappelons que l'étude n'a concerné « que » 10 950 plantes sur les millions qui sont présentes dans les zones étudiées. Il est donc possible qu'une mutation présente avec une très faible fréquence dans les populations échantillonnées ou qu'une mutation présente dans une population non échantillonnée n'ait pas été détectée. En outre, la présence de résistance non liée à la cible n'a pas été recherchée par ce test.

10 950 plantes à analyser ? C'est possible avec le SHD

Pour réaliser ce travail, nous avons analysé 10 950 plantes. La même étude réalisée par séquençage « classique » (méthode dite « Sanger », Figure 1) aurait nécessité d'extraire l'ADN de chacune de ces plantes individuellement, puis d'amplifier par PCR les trois fragments de l'ALS à partir de chaque extraction, et enfin de séquencer individuellement les fragments obtenus. Cela aurait impliqué de réaliser 10 950 extractions, 32 850 PCR et 32 850 réactions de séquençage « Sanger »... Autrement dit, mission impossible !

Avec le SHD, il a suffi de réaliser 219 extractions d'ADN (une extraction par prélèvement de cinquante plantes), 657 PCR pour obtenir les trois fragments de l'ALS et une réaction de SHD avec la technologie Illumina pour obtenir les mêmes données. Le gain de temps obtenu est donc considérable.

Qu'en est-il de la détection de la résistance non liée à la cible ?

Chez l'ambroisie, la résistance non liée à la cible (par exemple : détoxication exacerbée des herbicides) semble bien plus répandue que la résistance liée à la cible (Délye et al., 2015) (Meyer et al., 2020 ; voir article p. 34). Les mécanismes de résistance non liée à la cible n'ont pas été recherchés dans cette étude. En effet, pour pouvoir développer un test « ADN » de détection de ce type de résistance, il faut connaître non seulement les gènes en cause, mais aussi les mutations qui confèrent une résistance. Or, les gènes des mécanismes de résistance non liés à la cible sont encore inconnus chez l'ambroisie. Un travail de thèse conjoint entre l'Inrae, l'Anses et l'Acta est actuellement en cours sur ce sujet. Son but est de contribuer au développement d'outils moléculaires à haut débit pour la détection des résistances non liées à la cible chez l'ambroisie.

Une technique universelle

Cette étude a montré l'intérêt du SHD pour le diagnostic rapide de résistances aux inhibiteurs de l'ALS chez l'ambroisie. Mais les possibilités ne s'arrêtent pas là : ce qui a été possible pour l'ambroisie l'est aussi pour d'autres espèces. Le diagnostic par SHD peut tout aussi bien s'appliquer à d'autres espèces d'adventices chez lesquelles les mutations en cause dans la résistance sont connues, et les parcelles concernées nombreuses. On peut penser, par exemple, aux résistances aux inhibiteurs de l'ALS et de l'ACCase (groupe HRAC A) chez les graminées ou aux résistances aux inhibiteurs de l'ALS chez le coquelicot ou les matricaires. Cette technique peut aussi être utilisée pour détecter l'émergence d'une résistance. Il suffit dans ce cas d'analyser plus d'individus par parcelle, afin de pouvoir détecter de très faibles fréquences de résistants. En effet, plus une résistance est détectée précocement, moins il est difficile de se débarrasser des individus résistants. Enfin, au-delà des adventices, le diagnostic par SHD peut concerner tout bioagresseur (insecte, micro-organisme...) chez lequel une ou des mutations en cause dans une résistance à des phytos est connue. La seule limite à son emploi pourrait bien être la capacité à collecter les prélèvements sur le terrain. Si notre étude sur l'ambroisie a nécessité deux « runs » (unités de séquençage) de SHD Illumina pour analyser 219 prélèvements, les nouveaux développements de cette technologie permettent d'envisager de passer cent fois ce nombre de prélèvements sur un seul « run ».

(1) La classification HRAC (Herbicide Resistance Action Committee) répertorie les substances actives herbicides selon leurs modes d'action.