Les potentialités du chitosane contre les maladies de la vigne

Les performances du produit naturel chitosane sont explorées pour un usage contre l'eutypiose et l'esca.

Le chitosane (ou chitosan) est un composé naturel principalement extrait de la chitine des carapaces de crustacés ou d'insectes, ou encore de la paroi de champignons. Il est biodégradable et compatible avec d'autres produits biologiques. Ce polysaccharide est un exemple remarquable de produit de recyclage pouvant servir ensuite à de multiples usages. Son spectre d'applications est en effet très large (voir encadré page suivante). En protection des cultures, le chitosane est connu pour ses propriétés antivirales, antibactériennes, antifongiques et pour contribuer aux défenses naturelles des plantes (El Hadrami et al., 2010).

Afin de mieux comprendre le potentiel de protection des chitosanes et d'identifier le meilleur candidat possible pour un usage sur vigne, une étude a été entreprise sur une période de six ans dans le cadre d'une collaboration de recherche entre l'UMR Save de Bordeaux et la société Biolaffort.

Un mode d'action à préciser

Le mode d'action du chitosane en lutte directe vis-à-vis des bioagresseurs des plantes reste encore un peu énigmatique, très probablement parce que ses propriétés et son efficacité sont variables selon son origine. Le chitosane est obtenu par désacétylation chimique ou enzymatique de la chitine. Au regard de la littérature, son effet antimicrobien serait dépendant de son degré de désacétylation, son poids moléculaire, sa solubilité, sa viscosité, sa granulométrie, son pH, sa concentration et sa formulation (Kendra et Hadwiger, 1984 ; Signini and Campana-Filho, 1999 ; Rhazi et al., 2000 ; Wu et al., 2004 ; Eikenes et al., 2005 ; Rahman et al., 2015). Hormis un effet toxique direct sur le développement de bactéries ou de champignons, il a également été montré que ce polymère est capable de s'agglomérer et d'exercer un effet barrière pour protéger les voies d'entrée de plusieurs pathogènes (Hadrami et al., 2010) ou de former un biofilm pouvant améliorer l'état sanitaire et la qualité de semences, de fruits ou de légumes en pré- ou post-récolte (Bautista, 2005).

Sur vigne, le chitosane est une substance de base approuvée en tant qu'éliciteur des mécanismes de défenses contre les champignons et les bactéries pathogènes de la vigne. En matière de lutte directe, notamment pour prévenir les maladies de dépérissement, les études explorant le potentiel du chitosane et de ses dérivés sont encore peu nombreuses (Nascimento et al., 2007 ; Matei et al., 2010 ; Cobos et al., 2015 ; Buzón-Durán et al., 2021).

De très nombreux produits disponibles

De par le monde, il existe de très nombreuses possibilités d'approvisionnement en chitosanes de différentes origines. Entre 2016 et 2020, nous en avons rassemblé 23 au total. Tous ont été testés au moins une fois. Quatorze seulement ont fait l'objet de plusieurs essais. Leurs caractéristiques - origine et poids moléculaire (PM) notamment - sont détaillées dans le Tableau 1. Le premier objectif de notre étude a consisté à évaluer au laboratoire la capacité de chaque chitosane à contrôler la croissance mycélienne de plusieurs champignons pathogènes de la vigne, principalement ceux impliqués dans les maladies du bois (eutypiose et esca), mais aussi, à titre plus exploratoire, ceux responsables du mildiou, de l'oïdium et de la pourriture grise. Le Tableau 2 liste l'ensemble des neuf pathogènes testés, dont sept cultivables et deux parasites obligatoires (Plasmopara viticola et Erysiphe necator).

Étude in vitro avec des pathogènes cultivables

Le chitosane n'étant pas toujours très soluble dans l'eau, une méthode originale a donc été imaginée pour étudier in vitro l'efficacité des produits : les formulations ont été mises en suspension dans l'eau, régulièrement agitées, et un aliquot de 300 µl a été déposé à la surface de la gélose (photo page précédente). Après étalement des suspensions, chaque boîte de Petri est ensuite asséchée sous une hotte à flux laminaire avant de déposer au centre un implant mycélien (face du mycélium contre la suspension).

Entre 2016 et 2020, de nombreux essais ont été réalisés, tous selon le même mode opératoire. Trois concentrations de chitosane ont été testées : 0,05 %, 0,2 % et 1 %. Dans chaque essai, chaque produit testé à une dose donnée a fait l'objet de quatre répétitions (quatre boîtes).

Les plus lourds, les moins efficaces in vitro

Pour les trois concentrations testées, les chitosanes de fort poids moléculaire (PM > 300 kDa), quelle que soit leur origine et quel que soit le pathogène, ont systématiquement montré les niveaux d'efficacité les plus faibles. À l'inverse, les meilleurs pourcentages d'efficacité ont été observés avec les chitosanes de poids moléculaires les plus faibles, à savoir les oligochitosanes. L'origine du chitosane (champignon, crustacé ou insecte) n'a pas semblé avoir d'influence sur les niveaux d'efficacité obtenus.

La dose de 0,05 % ayant généré des niveaux d'efficacité globalement très faibles, et celle à 0,2 % des niveaux d'efficacité insuffisants, seuls les résultats des tests à 1 % sont présentés ici (Tableau 3). À cette dose de 1 %, les oligochitosanes O.Ce et O.F ont montré une efficacité remarquable vis-à-vis d'E. lata et la plupart des chitosanes de poids moléculaire inférieur à 100 kDa ont montré un bon potentiel de contrôle vis-à-vis de la plupart des champignons.

À l'issue de cette phase préliminaire de sélection in vitro, les meilleurs candidats contre l'eutypiose ou l'esca étaient : les oligochitosanes O.Ce et O.F et, parmi les chitosanes de taille moyenne, le chitosane LF. Ce dernier a été retenu pour la suite de l'étude en raison des nombreux résultats positifs obtenus et de sa disponibilité.

Un produit chimique de référence, aujourd'hui retiré du marché, le Topsin 70 WG (à base de méthyl-thiophanate), a été testé à la dose de 0,16 % à titre de comparaison (Tableau 3).

Étude in vitro avec les parasites obligatoires

Afin de tester le potentiel de protection du chitosane sur deux pathogènes aériens de la vigne, Plasmopara viticola, l'agent du mildiou, et Erysiphe necator, l'agent de l'oïdium, des tests biologiques classiques sur disques de feuilles détachées en survie ont été réalisés en 2019 selon une méthode éprouvée (Dufour et al., 2013). Trois chitosanes ont été testés : les oligochitosanes O.Ce, O.F et le chlorhydrate de chitosane H. Les feuilles ont été prélevées sur un cépage sensible au mildiou et à l'oïdium, le cabernet sauvignon. Les différentes formulations de chitosane ont été pulvérisées ou badigeonnés en préventif, avant l'inoculation (J et J-1).

Les oligochitosanes O.Ce et O.F ont permis de contrôler la croissance de ces deux pathogènes avec des doses très faibles. En application juste avant l'inoculation, ils ont des concentrations minimales inhibitrices (CMI) très similaires pour le mildiou (0,015 et 0,02 %). On observe une perte d'efficacité lorsqu'il se passe une journée entre l'application des chitosanes et l'infection avec Plasmopara viticola (CMI de O.Ce à 0,09 %). O.Ce et O.F présentent des efficacités identiques contre Erysiphe necator (CMI à 0,5 %) lorsqu'ils sont également appliquées extemporanément. Une perte d'efficacité est également observée lorsque l'application est réalisée un jour avant l'infection (CMI de 0,83 %).

Le chlorhydrate de chitosane H a montré la meilleure capacité à contrôler le développement de Plasmopara viticola (CMI de 0,0063 %) comparé aux autres formulations testées. L'aptitude du chitosane H à protéger les feuilles vis-à-vis d'Erysiphe necator est quant à elle moins importante (CMI = 4,5 %, dose pour laquelle le produit ne peut pas être pulvérisé mais appliqué en badigeon). À noter que les oligochitosanes O.Ce et O.F ont montré des signes de toxicité sur les feuilles (brunissement du limbe) à partir de la dose de 0,5 %. Aucun brunissement n'a été observé pour le chlorhydrate H.

Au vignoble : étude de l'aptitude à protéger les plaies de taille

Évaluation de l'application sur plaies fraîches avant ou après inoculation

En parallèle des essais in vitro, des essais au vignoble ont été mis en place à partir de 2016 pour évaluer in vivo le potentiel de plusieurs chitosanes à protéger les plaies de taille de vigne vis-à-vis des maladies du bois. Ces essais d'efficacité ont été réalisés au gré des réceptions de produits. Les doses utilisées au vignoble sont automatiquement augmentées par rapport à celles utilisées in vitro. La méthode de test choisie est la méthode CEB n° 155 (Lecomte, 2005), éditée par l'association Végéphyl (ex-AFPP). Cette méthode consiste à évaluer l'aptitude d'un produit à empêcher la germination d'une quantité connue de spores. Les traitements sont réalisés en fin d'hiver sur des plaies fraîchement taillées, par pulvérisation ou par badigeon, avant (préventif) ou après (curatif) l'inoculation d'une suspension de spores. L'efficacité est jugée sur la base de la fréquence de ré-isolement du champignon pathogène inoculé, soit selon le nombre de plaies infectées, soit selon le nombre de bûchettes infectées (indice de colonisation).

Essais 2016 et 2017 : des résultats inattendus

Le chitosane LF issu de champignon fut le premier chitosane testé au vignoble, vis-à-vis d'E. lata (2016 et 2017) et de P. chlamydospora (2017). Il a été pulvérisé à 5 ou 15 % ou badigeonné à 30 ou 38 %. Les résultats ont montré une réduction significative, en préventif, de l'infection par E. lata aussi bien en termes de sarments que de bûchettes, confirmée en 2017 (Tableau 4). En revanche, aucun effet significatif n'a été obtenu en préventif vis-à-vis de P. chlamydospora, ni en curatif vis-à-vis d'E. lata (2017).

Au cours de ces essais, nous avons constaté que le chitosane LF appliqué à forte dose formait une pellicule qui avait tendance à craqueler en séchant et à ne pas toujours se maintenir dans le temps sur les plaies de taille. Cette tendance peut expliquer sa baisse de performance dans l'essai de 2016 lorsqu'il a été dosé à 38 %.

Essais 2018 et 2019 : les oligochitosanes peu performants in vivo, le chlorhydrate de chitosane surprend

Bien que performant en préventif par badigeon, la propension du produit LF à craqueler en séchant et son coût à la concentration de 15 % ont découragé la poursuite de l'étude avec ce produit et le choix s'est porté sur l'oligochitosane O.Ce, performant in vitro, et le chlorhydrate de chitosane H, substance de base déjà exploitée pour un usage en agriculture.

Ces deux chitosanes ont été testés en 2018 vis-à-vis d'E. lata et de P. chlamydospora : O.Ce a été pulvérisé seul ou en mélange avec de l'acide acétique (AA, dosé à 2 % pour améliorer sa mise en suspension) et le chlorhydrate de chitosane H n'a été pulvérisé qu'en mélange à l'acide acétique. Seuls les résultats en préventif sont présentés dans le Tableau 5, les tests en curatifs n'ayant pas montré de résultats encourageants.

L'oligochitosane O.Ce, dosé à 5 %, a montré une aptitude préventive à protéger les plaies de taille comparable (25 %) sinon meilleure à celle du chitosane LF testé à la même dose dans l'essai de 2016 avec Eutypa lata (19 %). Cependant, aucun des produits testés n'a réduit de façon significative le taux d'infection des sarments. L'acide acétique n'a pas eu d'effet sur les champignons inoculés et n'a pas semblé nuire à l'efficacité des deux chitosanes testés. Mais l'efficacité de l'O.Ce n'a pas été améliorée en présence de ce solvant par rapport à l'O.Ce appliqué seul. Le chlorhydrate de chitosane H, combiné à l'acide acétique, a constitué la seule modalité à avoir permis de réduire significativement la colonisation d'E. lata et de P. chlamydospora au regard des bûchettes infectées. Ces résultats sont particulièrement surprenants en comparaison des tests in vitro.

En 2019 (Tableau 5), compte tenu du comportement encourageant de l'oligochitosane O.Ce en 2018, il avait été décidé d'augmenter la dose au-delà de 10 %. Le produit a donc été pulvérisé à 10 ou 15 %. Le chlorhydrate de chitosane H, maintenu dans l'essai, mais moins facile à pulvériser, a été badigeonné à 10 %. Contre toute attente, compte tenu des résultats précédents obtenus notamment in vitro, l'oligochitosane O.Ce, même pulvérisé aux doses de 10 et 15 %, n'a pas permis de réduire l'infection par E. lata et de P. chlamydospora. Seul un effet significatif de réduction de la colonisation de P. chlamydospora a été constaté à la dose de 15 %. En revanche, le chlorhydrate de chitosane H, badigeonné à la dose de 10 %, a montré une bien meilleure aptitude à protéger les blessures de taille, avec des taux d'efficacité tous supérieurs à la moyenne (sarments et bûchettes).

À notre connaissance, ce résultat n'avait jamais encore été mentionné dans la littérature et ce produit n'a pas non plus été commercialisé dans le cadre de la lutte contre ces deux pathogènes. Il semblerait que la viscosité élevée de ce chlorhydrate dès la dose de 5 % soit, à la fois, sa limite et son point fort : une pulvérisation très difficile mais une texture formant une barrière protectrice et durable à la surface des plaies de taille quand il est appliqué par badigeon.

Essais 2021 : le chlorhydrate de chitosane confirme son intérêt avec Eutypa lata

Les résultats obtenus précédemment avec le chlorhydrate de chitosane H étant encourageants, un complément d'étude a été décidé pour tester ce produit à des concentrations autorisant la pulvérisation (2 %) ou un badigeon au moindre coût (5 %). Un nouvel essai a ainsi été mis en place en mars 2021 pour évaluer l'efficacité vis-à-vis d'E. lata et de P. chlamydospora d'un autre chlorhydrate de chitosane disponible sur le marché, le HA, issu cette fois de crustacés. Chacun des pathogènes a été inoculé à raison de deux quantités de spores différentes, l'une plutôt classique et assez élevée d'environ 400 spores par plaie pour E. lata et 2 000 pour P. chlamydospora, et l'autre, représentant une pression d'inoculum plus faible, équivalente au tiers de ces doses, soit respectivement, environ 150 et 650 spores.

Avec Eutypa lata, qu'il soit inoculé à la plus forte ou à la plus faible quantité d'ascospores, le chlorhydrate de chitosane appliqué en préventif a réduit significativement les infections, que ce soit par badigeon à la dose de 5 % (63 % et 51 % d'efficacité) ou par pulvérisation à la dose de 2 % (61 % et 41 % d'efficacité) (Tableau 6). Cet effet est confirmé au regard des quantités de bûchettes infectées par le pathogène : 95 % et 86 % d'efficacité en badigeon et 68 % et 74 % d'efficacité par pulvérisation.

Avec Phaeomoniella chlamydospora, quelle que soit la quantité de spores exploitée, le chlorhydrate de chitosane appliqué en préventif n'a pas montré d'efficacité à réduire significativement les taux d'infection des plaies de taille (12 à 29 % d'efficacité), que ce soit par badigeon à la dose de 5 % ou par pulvérisation à la dose de 2 %. En revanche, concernant les taux de bûchettes infectées par le pathogène, l'effet du produit semble meilleur : 34 % et 31 % d'efficacité en badigeon et 44 % et 46 % d'efficacité par pulvérisation. Mais seul l'effet du badigeon a été validé comme étant significatif par les analyses statistiques avec la quantité la plus faible de conidies.

Cette différence d'efficacité, dépendante de la dose d'application et du champignon étudié, tend à confirmer l'effet barrière constaté par ailleurs : elle est interprétée comme étant dépendante de la taille des spores déposées sur le film protecteur que génère le produit après son application sur les plaies de taille. Les ascospores d'Eutypa lata ont une forme allongée en forme de bananes de longueur variable, 5-11 × 1,5-2 µm. Les conidies de Phaeomoniella chlamydospora sont plutôt ovales et plus petites 3-4 × 1-1,5 µm. Par extension, il est possible de penser que les autres champignons associés à l'esca, tels que les espèces du genre Botryosphaeria (spores dont la longueur est souvent largement supérieure à 6 µm) et du genre Fomitiporia (spores globuleuses, 6 × 6 <03BC>m en moyenne), pourraient être également contrôlées par ce type d'application.

Recherche du mode d'action du chlorhydrate de chitosane

Pour mieux comprendre l'opposition de résultats entre les essais in vitro et les essais in vivo, les premiers montrant le potentiel des oligochitosanes et, inversement, un faible niveau de performance des chitosanes de fort poids moléculaire, et les seconds montrant un effondrement de l'efficacité de l'oligochitosane O.Ce au vignoble et de façon inattendue un effet intéressant des chlorhydrate H et HA de poids moléculaire moyen, une étude complémentaire a été entreprise. La procédure est également empruntée à la méthode CEB 155 ; le principe général est également le même mais avec une période d'incubation de trois semaines seulement après traitement et inoculation des plaies de taille au vignoble (Lecomte, 2005 ; Reis et al., 2019). Au laboratoire, les tissus sous-jacents aux plaies de taille sont découpés en dix rondelles d'environ 1 mm d'épaisseur à partir de la plaie de taille (et non en bûchettes). Cet essai a été conduit en 2021. Six formulations, toutes dosées à 5 %, ont été testées : les oligochitosanes O.F et O.Ce, les chitosanes LF et Ca50 et le chlorhydrate de chitosane H, testé depuis le début de l'étude et, à l'essai, un troisième chlorhydrate, issu de crustacé, le HS. Les six formulations ont été badigeonnées en préventif sur des plaies de taille. Le lendemain, des suspensions de spores d'E. lata et de P. chlamydospora ont été déposées : 676 spores par plaie pour E. lata et 4 700 pour P. chlamydospora. Les résultats ont été interprétés au regard de deux variables : le taux d'infection des sarments (variable A) et le taux de colonisation des rondelles (variable B) (Tableau 7). Ils montrent une efficacité totale des chlorhydrates H et HS (100 %) vis-à-vis d'E. lata et de P. chlamydospora, les produits ayant empêché les spores de pénétrer en dessous de la surface des plaies de taille. Vis-à-vis d'E. lata, les chitosanes LF et Ca50 ont montré des effets partiels et les oligochitosanes O.Ce et O.F n'ont pas montré d'efficacité.

Cette étude complémentaire confirme l'interprétation des essais précédents et permet de conclure à un effet barrière, produit par le chitosane en s'agglomérant à la surface de la plaie de la taille. Ce résultat surprenant, inverse des essais in vitro, lesquels militaient pour un effet fongistatique, concorde avec l'emploi de ce type de produit dans le domaine médical pour assurer une protection physique. Cet effet de « piégeage des spores » aurait été observé par d'autres collègues (Pouzoulet, com. pers.).

Un effet barrière de certains chitosanes à optimiser sur le terrain

Cette étude avait pour but d'explorer le potentiel des chitosanes pour un usage en substance à faible risque sur vigne, selon une démarche expérimentale classique : de nombreux tests au laboratoire d'abord puis passage au vignoble. Des résultats contradictoires ont été obtenus entre les essais menés d'abord au laboratoire pour sélectionner des candidats in vitro et les essais in vivo pour démontrer ensuite l'aptitude des produits candidats à protéger les blessures de taille. In vivo, les meilleurs chitosanes étaient ceux de faible poids moléculaire, les oligochitosanes, quelle que soit leur origine (fongique ou animale). In situ, au vignoble, ce sont les chitosanes de poids moléculaire moyen, sous forme chlorhydrates notamment, qui se sont révélés les produits les plus performants. Ce type de chitosane semble capable de piéger les spores qui viendraient à se déposer à la surface des blessures ou des organes à protéger. Il agirait comme un pansement protecteur vis-à-vis des arrivées extérieures, son effet serait principalement physique, plus fongistatique que fongicide. Cet effet barrière a été confirmé par les analyses réalisées pour préciser son mode d'action. Il pourrait permettre d'empêcher plusieurs champignons pathogènes ascomycètes caractérisés par de grosses spores (notamment au sein des familles des diatrypacées, botryosphaeriacées, diaporthacées) et des basidiomycètes (par exemple le genre Fomitiporia...) de pénétrer dans le bois.

Une association du chitosane à des micro-organismes antagonistes pourrait offrir une nouvelle perspective de lutte biologique pour protéger les blessures de taille ou de recépage, voire les ceps curetés pour éviter de trop rapides réinfections. Autre avantage potentiel, le produit semble sélectif, car aucune phytotoxicité n'a été observée avec ce type de produit dans les essais mis en place au vignoble sur plaies de taille. Ces travaux ont fait l'objet d'un dépôt de brevet français sous le numéro FR2004922. Le potentiel de lutte observé avec le chlorhydrate de chitosane vis-à-vis des deux pathogènes aériens responsables de l'oïdium et du mildiou mérite d'être approfondi.

VALÉRIE MAYET(1), PASCAL LECOMTE(2), MARIE-CÉCILE DUFOUR(2), BASTIEN NAZARIS(1), LUCILE BADET(3), CHARLOTTE GOURRAUD(1) ET VIRGINIE MOINE(1) (1) Biolaffort - Floirac. (2) Inrae, université de Bordeaux, ISVV, Bordeaux Sciences Agro, UMR Save - Villenave-d'Ornon. (3) Almavitis - Floirac