Un chitosane... des chitosanes ?

La grande famille de molécules que représente le chitosane connaît un fort intérêt depuis plus de 50 ans. Éclairage sur les connaissances actuelles de ce polysaccharide naturel et les nécessités de mieux le caractériser.

En raison de ses nombreuses propriétés biologiques, de sa faible toxicité envers les mammifères et de sa biodégradabilité (Aranaz et al., 2009), le chitosane est largement étudié et déjà utilisé dans divers domaines d'application tels que le médical, la cosmétique, l'agroalimentaire ou encore le traitement des eaux (Pokhrel S., Yadav P. N. et Adhikari, 2015). L'intérêt du chitosane en agriculture, plus particulièrement pour la protection des cultures, est connu depuis des décennies (Allan et Hadwiger, 1979) et lui a permis d'obtenir le statut de substance de base en Europe (voir encadré page suivante). En dépit de son potentiel dans l'objectif de réduction des risques liés à l'utilisation de pesticides, son développement a été freiné par sa nature complexe et un manque de connaissances sur les paramètres influençant son efficacité biologique. Les connaissances acquises ces dernières années sur la relation structure/activité du chitosane, ainsi que les avancées technologiques qui ont eu lieu dans le même temps ont permis le développement industriel de nouveaux chitosanes bien caractérisés et optimisés pour la protection des cultures.

Chitosane : de quoi parle-t-on ?

Différentes origines

À la différence de la majorité des substances actives couramment utilisées en protection des plantes, le chitosane n'est pas une substance unique mais représente une large famille de polysaccharides naturels comme peuvent l'être la cellulose ou l'amidon, par exemple. Ces polysaccharides sont dérivés de la chitine, un des biopolymères les plus abondants sur Terre dont la synthèse par les organismes vivants est estimée à plus de 1010 tonnes par an (Gooday, 1990), parmi lesquelles 2,3 milliards de tonnes seraient attribuables aux crustacés marins (Jeuniaux et al., 1993), faisant de cette matière première une ressource renouvelable de grand intérêt. De plus, la chitine étant principalement obtenue à partir de co-produits issus de différentes industries, notamment agroalimentaires (produits de la mer, production de protéines d'insectes, etc.), elle s'inscrit parfaitement dans le concept d'économie circulaire.

Les paramètres constitutifs, à l'échelle de la molécule

D'un point de vue moléculaire, la chitine et le chitosane sont des polymères formés par la liaison covalente d'un nombre et d'une proportion variables de deux monosaccharides (oses) : la N-acétylglucosamine (GlcNAc) et la glucosamine (Glc), cette dernière se différenciant de la première uniquement par l'absence d'un groupe acétyle (-CH3CO) sur la fonction amine (Figure 1). La proportion de N-acétylglucosamine dans la molécule est appelée degré d'acétylation (DA), il s'agit de l'un des trois paramètres constitutifs des molécules de chitine ou de chitosane et également celui qui permet de les différencier. En effet, bien qu'aucun consensus scientifique n'existe à ce jour sur la frontière les séparant, on considère généralement que la chitine devient du chitosane lorsqu'elle est désacétylée à plus de 50 % (DA moins que 50 %).

Le second paramètre constitutif d'une molécule de chitosane est sa longueur, qui est fonction du nombre de monomères qui la composent. Ce paramètre est appelé degré de polymérisation (DP). Les petites molécules de chitosane dont le DP est compris entre 2 et 20 sont appelées oligomères ou chito-oligosaccharides (COS) et les grosses molécules dont le DP est supérieur à 100 sont appelées polymères. Il n'existe pas de terme précis pour caractériser les molécules ayant un DP compris entre 20 et 100, elles sont parfois qualifiées de petits polymères ou de grands oligomères.

La masse (ou poids) moléculaire (MM) d'une macromolécule de chitosane, correspondant à la somme de tous les atomes qui la composent, dépendra majoritairement de son DP, bien que le DA exerce également une légère influence. Pour deux polymères de chitosane d'un même DP, celui ayant un DA plus faible aura également une MM plus faible. Cela s'explique par la masse moléculaire plus faible d'un monomère de glucosamine (179,17 Da) en comparaison à celle d'un monomère de N-acetyl-glucosamine (221,21 Da), ce dernier ayant un groupement acétyle supplémentaire. En prenant l'exemple de deux polymères de chitosane avec un DP=100, celui ayant un DA = 0 aura une MM de 17,9 kDa tandis que celui ayant un DA = 20 aura une MM de 18,7 kDa.

L'ordre dans lequel les monomères sont liées le long de la molécule, appelé motif d'acétylation (Pattern of acetylation, PA), peut également être déterminé et classé en quatre catégories : aléatoire, en blocs, régulier ou à motifs. Les avancées technologiques actuelles, tant au niveau du process de production que des techniques analytiques, rendent la maîtrise de ce paramètre et sa détermination en routine assez complexe. Ces trois paramètres (DA, DP et PA) sont illustrés en Figure 1.

Enfin, il est possible d'améliorer la solubilité du chitosane en le dissolvant dans des acides dilués et en produisant ainsi des sels. Ainsi, le chlorhydrate de chitosane approuvé au niveau européen sous le statut de substance de base (règlement d'exécution (UE) n° 563/2014(1)) est le sel formé à partir d'acide chlorhydrique.

À l'échelle de l'échantillon

Un échantillon de chitosane résultant d'un procédé de production industriel sera toujours composé de plusieurs molécules qui diffèreront par leur DA, DP, PA et pourront par conséquent présenter des activités différentes, ajoutant ainsi un autre degré de complexité. En effet, des travaux de recherches récents portant sur l'activité fongicide du chitosane ont démontré que des interactions synergiques pouvaient se produire entre certaines molécules bien précises. Un échantillon sera donc caractérisé par un DA moyen, correspondant à la moyenne des DA de toutes les macromolécules qui le constitue, ainsi que par un indice de polydispersité (PI) qui caractérise quant à lui l'hétérogénéité ou diversité des tailles des macromolécules le composant.

Mode d'action et paramètres d'influence

Des activités biologiques différentes selon les propriétés du chitosane

De nombreux articles scientifiques décrivent l'intérêt du chitosane en agriculture, principalement pour ses propriétés de biocontrôle mais également pour certaines activités biostimulantes, de formulant ou encore de biorémédiation des sols, et ce de manière croissante depuis 2011 (Li et al., 2020). Cependant, comme l'illustre très bien l'article intitulé « Les potentialités du chitosane contre les maladies de la vigne », paru dans l'édition de novembre 2022 de Phytoma (n° 758), toutes les molécules de chitosane n'ont pas les mêmes activités biologiques, celles-ci étant dépendantes de certains paramètres constitutifs. Afin d'aboutir à un produit efficace et optimal pour une application donnée, il est donc crucial d'identifier les propriétés du chitosane (DA, DP, PI, etc.) qui influencent son activité biologique recherchée, mais également de déterminer par quels facteurs sont influencées ces propriétés (procédé d'obtention, nature et qualité de la matière première, etc.). En ce qui concerne les activités du chitosane recherchées en protection des plantes, elles seront majoritairement modulées par son DP, qui influence sa taille et donc sa biodisponibilité, ainsi que par son DA qui influence sa nature plus ou moins cationique, les unités glucosamine présentant une charge positive en milieu acide grâce à leur groupement amine libre (pKa = 6,5) contrairement aux unités acétylées. Plus récemment, certaines études semblent également suggérer que le PA du chitosane, c'est-à-dire l'ordre dans lequel les unités acétylées et désacétylées sont liées, aurait un impact sur ses activités biologiques (Basa et al., 2020 ; Cord-Landwehr et al., 2016).

Induction des défenses des plantes

Comme le synthétise la revue de Katiyar et al. publiée en 2015, de nombreuses études décrivent la capacité du chitosane à renforcer les défenses naturelles des plantes. En effet, ces dernières possèdent un système de détection des pathogènes reposant sur des récepteurs capables de reconnaître les motifs moléculaires associés aux microbes (MAMPs). Le chitosane étant un dérivé de la chitine, composant universel de la paroi cellulaire des champignons, il semblerait qu'il soit reconnu par des récepteurs spécifiques. Cet effet éliciteur déclenche chez la plante une réponse immunitaire puissante et généralisée appelée SAR (Systemic Acquired Resistance). Cela se traduit par la synthèse de molécules de défense telles que les phytoalexines, les protéines PR, les enzymes antioxydantes et les phytohormones comme l'acide salicylique (El Hadrami et al., 2010 ; Aziz et al., 2006). La stimulation des plantes par le chitosane permet également le renforcement de leurs parois pectocellulosique (Bautista-Baños et al., 2006).

Parce que la réponse globale nécessite la synthèse de nouvelles molécules, une certaine période de latence est nécessaire avant que les défenses d'une plante non stimulée soient optimales lorsqu'elle rencontre un agent pathogène. À l'inverse, une plante préalablement stimulée disposera directement de tout l'arsenal nécessaire pour combattre les pathogènes, lui conférant ainsi un avantage précieux (Conrath et al., 2006).

L'efficacité de l'activité élicitrice du chitosane sera modulée par ses paramètres moléculaires. En effet, il est reconnu que les COS sont de meilleurs éliciteurs que les longs polymères car ils pourront atteindre plus facilement les récepteurs, étant donné leur plus petite taille et donc leur moindre encombrement stérique(2) (Aziz et al., 2006 ; Seyfarth et al., 2007). Il est également postulé que cet effet est saturant, le déclenchement du système de défense de la plante étant une réponse binaire et non graduelle. Enfin, un article scientifique publié par Basa et al. en 2020 souligne l'influence du motif d'acétylation, expliquée par le fait que la réponse cellulaire aux chitosanes est susceptible d'impliquer des récepteurs reconnaissant des motifs moléculaires. L'étude qui consistait à tester l'activité d'amorçage de tétramères de chitosane monoacétylés (DP = 4, DA = 1) avec différents PA dans des cellules de riz a démontré que seuls certains d'entre eux étaient actifs. Il s'agit d'une des premières preuves expérimentales de l'impact du PA sur la bioactivité des chitosanes, ouvrant ainsi la voie à un nouveau champ de recherche sur l'influence de ce paramètre sur ses activités (Basa et al., 2020 ; Cord-Landwehr et al., 2020 ; Wattjes et al., 2020).

Effets directs sur les pathogènes

L'effet antimicrobien du chitosane est connu, notamment dans le secteur médical, et de nombreuses études in vitro ont mis en évidence son potentiel d'inhibition de la croissance des pathogènes bactériens et fongiques, ainsi que de la germination des spores fongiques (Lopez-Moya, Suarez-Fernandez et Lopez-Llorca, 2019, Sharif. et al., 2018). En fonction du pathogène étudié, du type de chitosane et de sa concentration, ce dernier peut exercer un effet qualifié de bactéricide/fongicide ou bien bactériostatique/fongistatique, signifiant qu'il limitera la croissance du pathogène sans pour autant le tuer (Cota-Arriola et al., 2011 ; Freddo et al., 2014). Il existe un certain nombre d'hypothèses sur le mode d'action précis du chitosane permettant d'aboutir à ces effets directs, comme la chélation des oligo-éléments nécessaires à la croissance microbienne, ou la formation d'une couche de chitosane entourant les cellules microbiennes bloquant ainsi l'absorption des nutriments (Yan et al., 2021). L'hypothèse la plus convaincante suppose des dommages membranaires et pariétaux dus à la nature polycationique des polymères de chitosane pouvant interagir avec certains composants des membranes et parois des bactéries et champignons pathogènes. Cette interprétation est soulignée par le fait que les activités antimicrobiennes les plus élevées sont présentées par des chitosanes avec un très faible DA et, par conséquent, de nombreux groupes amino libres portant une charge positive (Younes et al., 2014).

La taille des molécules de chitosane semble également influencer cet effet direct. Ainsi, les petits polymères (20 > DP > 50), aussi qualifiés de grands oligomères par certains auteurs, semblent plus efficaces que les longs polymères (DP > 50), eux-mêmes plus efficaces que les COS (DP < 20) (Attijoui et al., 2021 ; Rahman et al., 2015).

Contrairement à l'effet éliciteur du chitosane qui serait basé sur un mécanisme moléculaire, l'effet direct semble quant à lui être dose-dépendant, l'inhibition de la croissance augmentant en même temps que sa concentration. De plus, une étude réalisée par Attjioui et al. en 2021 sur des chitosanes bien caractérisés a démontré de manière inédite un fort effet synergique entre des polymères et oligomères spécifiques sur l'inhibition de la germination des conidies et de la croissance fongique de Fusarium graminearum. Ces résultats mettent en lumière l'influence du PI d'un échantillon de chitosane sur ses activités antimicrobiennes et soulignent pour la première fois l'intérêt de combiner certains polymères et oligomères spécifiques de chitosane afin d'optimiser son efficacité.

Conclusion et perspectives

Ces dernières années, les progrès de la recherche sur la caractérisation et l'activité associée des chitosanes permettent de comprendre la complexité de cette famille de molécules. Les caractéristiques d'un chitosane sont définis par l'origine de la ressource et surtout par le processus de production industrielle. Afin de mettre sur le marché des produits à base de chitosane efficaces et adaptés à leur usage, les industriels doivent prendre en compte l'ensemble de ces données et définir comment communiquer avec leurs clients et l'utilisateur final. Les données scientifiques citées dans cet article confirment que la performance des chitosanes en protection des plantes est portée par deux activités biologiques obtenues par deux types de chitosanes distincts. Dans le secteur des productions végétales, le regain d'intérêt pour les produits d'origine naturelle non toxiques, et plus particulièrement ceux issus de l'économie circulaire, va favoriser le développement commercial des chitosanes bien caractérisés et dont la performance aura été démontrée.

(1) Règlement d'exécution (UE) n° 563/2014 de la Commission du 23 mai 2014 portant approbation de la substance de base « chlorhydrate de chitosane », conformément au règlement (CE) n° 1107/2009 du Parlement européen et du Conseil concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques, et modifiant le règlement d'exécution (UE) n° 540/2011 de la Commission.(2) Le terme stérique dérive du terme grec stereos, qui signifie « solide ». La signification de stérique en chimie est centrée sur l'arrangement spatial ou 3D. L'encombrement stérique d'une molécule se réfère donc au degré d'espace occupé par les atomes qui la composent.