Gestion des modes d'action pour une protection durable du blé

La protection fongicide en grandes cultures doit reposer sur une approche de plus en plus technique et agronomique, avec l'adoption de stratégies efficaces dans un esprit de durabilité. Cela implique d'anticiper et de gérer les modes d'action fongicides de façon responsable. Nous allons nous intéresser ici au cas de la septoriose du blé causée par Septoria tritici et aux fongicides IDM(1) de la famille des triazoles. Avec des résultats récents de suivi de sensibilité (monitoring) des populations et de technologies de laboratoire innovantes.

Les fongicides, contribuant à améliorer les rendements et la qualité des récoltes, sont et resteront utilisés en stratégies intégrées de gestion des cultures en systèmes conventionnels. Mais leur usage non raisonné peut entraîner un risque de perte de leur efficacité par sélection de souches moins sensibles et/ou résistantes.

La résistance aux fongicides est ainsi devenue un problème pratique pour les agriculteurs et les sociétés mettant au point et distribuant les fongicides.

Bilan 2011

Mécanismes de résistance

Le suivi de la sensibilité des populations naturelles d'agents pathogènes aux molécules antifongiques (ou monitoring) est primordial afin d'évaluer le plus précisément possible le risque de sélection et/ou extension de résistances. L'objectif final étant de définir des stratégies les plus adaptées de gestion des résistances, spécifiques à chaque mode d'action fongicide.

Les nouvelles générations de fongicides ont des modes d'action spécifiques (unisites), visant une seule enzyme ou une voie biochimique précise. Les mécanismes de résistance liés à ces fongicides, multiples, peuvent impliquer :

– un efflux augmenté de substances actives via la surexpression de protéines de transport (mécanisme non spécifique d'une famille chimique et rencontré chez les souches de type « multidrug-resistant » ou « MDR » ; Leroux & al., 2006, 2009 ; Leroux & Walker, 2011 ; Walker & al., 2011),

– des processus de détoxification,

– la surexpression de la protéine-cible,

– la sélection de mutations ponctuelles au niveau de cette même protéine-cible.

L'évolution de la sensibilité aux fongicides des agents pathogènes des plantes paraît reposer surtout sur ce dernier mécanisme d'altération du site d'action du fongicide.

Cette évolution peut être brutale et rapide (résultant d'une mutation unique au niveau d'un gène, cas des strobilurines), ou plus progressive (résistance souvent de type polyallélique, cas des triazoles).

Le niveau de risque de sélection et/ou d'extension d'une résistance à un fongicide donné dépend donc de son mode d'action et des modes d'action complémentaires disponibles pour l'usage concerné, de son utilisation, du type de résistance sélectionné (donnée inconnue lors du lancement d'un mode d'action sur le marché) et de l'évolution des populations du champignon-cible portant cette résistance.

S. tritici et triazoles, état des lieux

Les IDM (inhibiteurs de la déméthylation), dont les triazoles, agissent sur la 14 a-déméthylase (CYP51) en induisant un appauvrissement de l'ergostérol, principal constituant des membranes cellulaires fongiques. Les IDM, mis au contact des agents pathogènes-cibles, augmentent la perméabilité des membranes fongiques. Ceci favorise la lyse cellulaire et, donc, la mort prématurée des agents pathogènes.

L'Unité de recherche BIOGER-CPP(2) de l'INRA a développé un test biologique de caractérisation des souches de Septoria tritici, agent de la septoriose du blé, en fonction de leur sensibilité à divers triazoles : il s'agit au départ de caractérisation phénotypique (TriR-types). En parallèle, des tests moléculaires permettant de relier certains de ces phénotypes à des modifications de la structure de la protéine-cible des triazoles (donc de lier phénotypes et génotypes) ont été mis au point.

Les tests phénotypiques réalisés en 2011 ont permis d'observer l'évolution des fréquences de souches de S. tritici prélevées lors du monitoring dans chaque classe principale (Tableau 1) : phénotypes sensibles (TriS), légèrement résistants (TriLR), modérément résistants (TriMR) et hautement résistants (TriHR). Plus de 98 % des populations de S. tritici se situent dans la gamme de sensibilité des années précédentes : Tri LR (TriR1→TriR5) et TriMR (TriR5+→R12, dont certains sont des phénotypes émergents non MDR, voir Tableau 1).

Comme en 2010, les phénotypes émergents TriHR (MDR) restent rares (< 2 %).

Ce qu'apporte la modélisation moléculaire

Comprendre l'impact d'une mutation sur l'activité des triazoles au laboratoire

Nous l'avons vu, la résistance des agents pathogènes aux fongicides est principalement basée sur la présence de mutations ponctuelles au niveau de la cible. À ce jour, certaines mutations au niveau de CYP51 ont été décrites pour modifier la sensibilité aux triazoles chez divers champignons pathogènes de plantes. Curieusement, ces mutations sont toujours observées combinées avec des délétions d'acides aminés ou des mutations dans la région YGYG aux positions 459-462 (Tableau 2).

Pour comprendre les implications structurelles de ces mutations induisant des sensibilités réduites aux triazoles observables au laboratoire, ainsi que leurs effets sur la liaison de ces molécules à leur site d'action (CYP51), les laboratoires BASF ont développé des études de modélisation moléculaire (Figure 1).

Nous avons ainsi observé qu'une mutation au niveau de la protéine-cible CYP51 – substitution de la thréonine (Y) par la phénylalanine (F) en position 137 chez les souches TriR3 par exemple (Tableau 2) – peut modifier la conformation spatiale de cette protéine, augmenter ou diminuer son volume, la rendre plus hydrophile, etc., et, donc, empêcher une fixation optimale des molécules triazoles.

De plus, nous avons montré que les mutations de CYP51 susceptibles d'avoir un impact sur l'efficacité des triazoles en conditions de laboratoire se situent au niveau du site de fixation des triazoles (= site de reconnaissance du substrat SRS), et qu'un triazole n'a pas la même activité qu'un autre sur ces mutations ou combinaisons de mutations. On parle d'activité intrinsèque des molécules.

Examiner de plus près les principales mutations

Dans un premier temps, voyons les mutations V136A, Y137F, A379G et I381V. Nos études ont montré qu'elles conduisent toutes à une réduction de la taille et du volume des chaînes latérales (Figure 1). À côté de cette caractéristique commune, chaque mutation peut présenter une ou plusieurs caractéristiques propres.

Ainsi, la mutation A379G augmente localement la flexibilité du site de fixation des triazoles ce qui entraînerait une déstabilisation de la liaison des triazoles à ce résidu.

Les mutations V136A et Y137F, situées sur le SRS1 (Figure 1) au niveau de l'une des deux voies d'accès au site actif de CYP51, suggèrent que ces résidus sont davantage impliqués dans le processus d'entrée de l'époxiconazole (ou IDM à structure similaire) puisqu'ils n'ont aucun contact direct avec la molécule fongicide.

D'autres études suggèrent que la substitution de l'isoleucine par la valine en position 381 (mutation I381V, au contact direct du fongicide), au niveau du SRS5, ne modifie pas le mode de liaison de l'époxiconazole mais réduit sensiblement son affinité de liaison à CYP51.

Cependant, dans les populations actuelles de S. tritici, les mutations apparaissent plus souvent combinées qu'isolées. Ainsi, la combinaison des mutations A379G et I381V (souches TriR8) aurait un impact plus fort sur l'affinité de liaison des triazoles à leur site d'action que chaque mutation seule. La comparaison de la moyenne et de la répartition des valeurs de DE50, in vitro, des souches TriR7 (I381V) et TriR8 (I381V + A379G) soutient cette observation (Figure 2).

Dans un second temps, intéressons-nous à une mutation apparue plus récemment : la mutation S524T. Elle a été identifiée pour la première fois en 2009 chez des souches de S. tritici prélevées en Irlande. Localisée au niveau du SRS6, elle représente une exception comparée aux précédentes. En effet, la substitution de la sérine (S) par la thréonine (T) entraîne l'obtention d'une chaîne latérale plus volumineuse pouvant suggérer un impact plus important sur l'interaction entre les triazoles et leur site d'action.

Le prochloraze, une molécule à part

Ce système de modélisation a vu ses limites dans le cas du prochloraze, imidazole dont la cible est la même que celle des triazoles. Une technologie complémentaire, la simulation de dynamique moléculaire, a alors été développée sur ce système.

Elle suggère qu'un mode de fixation alternatif, non encore totalement élucidé, permettrait au prochloraze de stabiliser l'impact des mutations I381V et A379G + I381V.

Hypothèse à souligner, sachant que ces mutations, isolées ou combinées, se trouvent chez les souches les plus répandues dans les populations françaises, à savoir les souches MR (Tableau 1).

En résumé, les modèles de protéines en trois dimensions combinées avec les principes connus de la biologie structurale et de la reconnaissance moléculaire fournissent des outils supplémentaires permettant d'expliquer ou, au moins, d'aider à comprendre, l'impact de l'usage d'une molécule donnée sur la structuration des populations de microorganismes pathogènes (cas du prochloraze qui, en pratique, a montré un intérêt dans la contre-sélection des souches MR au profit des souches LR).

Comment exploiter les données de laboratoire dans la pratique ?

Nos tests biologiques

Depuis plusieurs années, les observations faites en laboratoire montrent que la sensibilité des populations de S. tritici aux triazoles a évolué. Mais l'absence de lien direct avec l'efficacité au champ des meilleures molécules (notamment l'époxiconazole, seul ou associé au metconazole, et le prothioconazole) utilisées aux doses préconisées rend la situation plus difficile à comprendre.

Afin de relier les résultats de laboratoire et les observations au champ, si tant est qu'il y ait un lien direct, dans le but d'optimiser les stratégies de gestion des résistances, des tests biologiques sont réalisés chaque année.

Des isolats de S. tritici prélevés au champ et préalablement caractérisés génotypiquement sont confrontés à l'époxiconazole, en plaques de microtitration, pour mesurer leur sensibilité.

Les modifIcations de CYP51 n'expliquent pas tout

Les résultats montrent des sensibilités (valeurs de DE50) des souches testées réparties sur une large gamme de concentrations, quel que soit

le phénotype (au sens de TriR-type) considéré. Certaines souches MR, classées en théorie parmi les moins sensibles, ne le sont pas toujours dans le test (Figure 2). Il y a des souches Tri-R8 (MR) aussi sensibles que certaines Tri-R5 (LR) voire certaines souches sensibles (WT).

Cette observation suggère que la contribution des modifications de la structure de CYP51 (modifications du génotype) dans la réponse de sensibilité à l'époxiconazole (aux IDM en général) est limitée et que d'autres mécanismes sont impliqués.

Par conséquent, n'avoir que les fréquences de phénotypes au sens de TriR-type c'est-à-dire traduisant les génotypes (modifications de CYP51) ne retranscrit pas complètement la sensibilité moyenne des populations de septoriose.

Importance du maintien de la diversité des IDM

Par ailleurs, différentes mutations présentées ci-avant, à savoir V136A, A379G, I381V et S524T, ont été testées vis-à-vis de différents IDM, en laboratoire, afin d'observer l'activité de chacune de ces molécules sur ces dernières (Tableau 3).

Il en ressort que les IDM testés ne se comportent pas de la même façon suivant la mutation de CYP51 envisagée. Par exemple, l'époxiconazole, le metconazole et le prochloraze présentent des activités complémentaires.

Si nous transposons ce résultat à la pratique, à l'échelle du champ, cela signifie qu'utiliser plusieurs IDM dans la lutte contre la septoriose serait une stratégie à mettre en application pour ne pas sélectionner massivement un phénotype résistant particulier. Donc, baser un programme sur la diversité des familles chimiques, mais aussi des molécules au sein d'une même famille, apparaît comme une solution optimisée pour gérer les modes d'action fongicides en céréaliculture.

Conclusions

Il faut savoir que la résistance est la réponse évolutive d'une population soumise à un stress et que, de façon générale, elle se développera tôt ou tard pour n'importe quelle molécule fongicide spécifique nouvellement introduite sur le marché. De ce fait, l'objectif premier d'une stratégie de « gestion des modes d'action fongicides », à défaut de fournir LA solution, est de garantir le maintien d'une efficacité optimale de la lutte dans l'espace et le temps.

Pour espérer atteindre cet objectif, la gestion de la résistance doit être collective : sociétés phytopharmaceutiques, autorités responsables de l'homologation, scientifiques, prescripteurs, distribution et agriculteurs. Les stratégies doivent être claires (ex. : gérer uniformément toutes les molécules à mode d'action donné), facilement applicables (ne pas supprimer d'outils sans apporter de solutions de substitution), associées aux règles de bonne pratique phytosanitaire et utilisées à la plus large échelle possible.

BASF Agro a développé une large expertise en matière de gestion des modes d'action fongicides, avec d'une part l'utilisation d'outils de modélisation informatique permettant de comprendre les interactions entre les molécules fongicides et leur site d'action et, d'autre part, la conduite de monitorings pour suivre l'évolution de la sensibilité des populations d'agents pathogènes à ces molécules.

Ainsi, chez la septoriose (S. tritici), la modélisation moléculaire a permis d'apporter des éléments importants dans la compréhension de l'impact des mutations de l'enzyme-cible des IDM (CYP51) sur l'activité des triazoles : mise en évidence d'une déstabilisation moléculaire de la liaison des triazoles à leur cible (mutation A379G), d'une perturbation de l'accès des triazoles à leur site d'action (mutations V136A et Y137F) ou encore de réduction de l'affinité des triazoles à leur cible (mutations S524T, I381V, A379G et A379V + I381V).

De plus, la simulation de dynamique moléculaire a suggéré que le prochloraze présente un mode de fixation alternatif susceptible de stabiliser l'impact des mutations les plus représentées dans les populations françaises (I381V et A379G + I381V).

Les monitorings, malgré l'année 2011 peu favorable au développement de la septoriose, ont montré que la sensibilité moyenne des populations de S. tritici n'avait pas évolué par rapport à 2010. Et que, pour maintenir un contrôle efficace de la septoriose (voire du complexe parasitaire) associé à une gestion optimisée de la résistance, il est important de :

1. Maintenir la diversité des triazoles (par définition, l'activité intrinsèque d'un triazole lui étant propre, il est judicieux d'utiliser les molécules les plus performantes pour une efficacité en champ optimisée) et des modes d'action.

2. Associer et alterner les partenaires des triazoles (SDHI, chlorothalonil, prochloraze, triazoles).

3. Appliquer les règles de bonnes pratiques culturales et agronomiques afin de limiter la quantité d'inoculum primaire et la progression des maladies.

<p>* BASF. arnaud.cousin@basf.com</p> <p>(1) Inhibiteurs de la déméthylation des stérols.</p> <p>(2) BIOlogie et GEstion des Risques en agriculture-Champignons Pathogènes des Plantes.</p>