Deux expérimentations, l'une sur le diagnostic précoce de la maladie et l'autre, très préliminaire, sur un moyen de protéger les arbres.

Identifiée fin des années 20 aux États-Unis, la maladie du chancre coloré du platane n'a cessé de gagner du terrain : Amérique du Nord, Europe, Asie. En France, après son introduction à Marseille en 1945, le parasite s'est répandu dans le sud-est, atteignant ensuite Lyon, l'Ain, la Savoie puis le sud-ouest jusqu'à Montauban et Saint-Gaudens, s'installant au passage sur les platanes du canal du Midi.

Face à l'impossibilité de soigner efficacement les platanes dépérissants, une étude a été menée, d'une part sur la détection précoce, d'autre part sur les recherches de traitement curatif/ préventif. En voici l'écho.

La détection aujourd'hui

Identification de Ceratocystis platani par tests biologiques

Actuellement, on peut détecter Ceratocystis platani par des tests biologiques simples, à savoir la mise en culture du champignon à partir de prélèvements sur du bois présentant des symptômes suspects (Lefort, 2007). C. platani, s'il est présent dans le bois à tester, apparaît sur le milieu de culture au bout d'une semaine sous forme de mycélium et de périthèces.

Toutefois, cette méthode permet seulement de confirmer des soupçons d'infection d'un arbre sur la base de symptômes que cet arbre présentait. Elle n'est donc pas applicable en détection précoce de la maladie ni comme méthode de suivi environnemental. Par ailleurs, la méthode ne permet pas de traiter de nombreux échantillons vu le temps de travail nécessaire.

Demain, l'ADN comme cible de détection

Étude de faisabilité d'un outil de détection précoce du chancre coloré : le cahier des charges

À partir de ce constat, nous avons entrepris la conception d'un outil innovant pour la détection précoce du chancre coloré du platane.

Le cahier des charges de cet outil contenait les points principaux suivants :

– il devait détecter précocement la maladie, à savoir apporter une réponse sur la présence ou non du champignon agent du chancre coloré avant symptôme manifeste (apparition des nécroses, flamme colorée, défeuillaison...) ;

– il devait pouvoir discriminer ce qui est C. platani de ce qui ne l'est pas. En effet, les tissus nécrosés par l'infection de C. platani sont immédiatement colonisés par une succession d'autres champignons. Ces derniers, leurs corps de fructification apparaissant parfois sur les tissus corticaux, rendent difficile l'identification de l'agent pathogène à l'origine de l'infection ;

– il devait pouvoir traiter de nombreux échantillons en un minimum de temps afin d'optimiser la réactivité d'intervention et la multiplication des prélèvements ;

– la manipulation avant l'utilisation de l'outil lui-même, à savoir les prélèvements d'échantillons à analyser, devait être la plus minime possible et la plus adaptée à la localisation du champignon ;

– enfin idéalement, l'outil devait être transportable en « laboratoire mobile » permettant une rapidité d'analyse pour préserver l'intégrité biologique des échantillons ainsi qu'une aisance d'intervention.

Réponse : la PCR quantitative

Pour répondre à ce cahier des charges, une technique de biologie moléculaire a été développée. Il s'agit de l'amplification par la réaction de la polymérase en chaîne (PCR) spécifique d'une séquence nucléotidique de C. platani que nous avons déterminée après étude des différents gènes candidats potentiels.

Nous avons choisi une méthode d'amplification quantitative en temps réel. Elle permet de détecter avec précision la présence de C. platani, de quantifier ce qui est détecté en quantité ADN et, par inférence à partir de la courbe d'étalonnage, en nombre de spores présentes dans l'échantillon prélevé.

Etape laboratoire

Une étape préliminaire en laboratoire a été effectuée afin de vérifier la validité et la robustesse du test conçu.

La méthode du dosage Q-PCR Taqman de C. platani, mise au point à partir de la séquence nucléotidique cible, a été techniquement validée in vitro. Elle permet d'établir une gamme de matrice plasmidique étalon reproductible, présentant des caractéristiques de linéarité, d'efficacité PCR et de sensibilité conformes aux exigences de ce type de technique. De plus, elle présente un seuil de détection moléculaire inférieur au seuil du nombre de spores nécessaires pour initialiser une infection (Vigouroux, 2004), de l'ordre du dixième de celui-ci.

La qualité des résultats obtenus suivant ce protocole permet d'envisager la phase finale de faisabilité in vivo à partir d'échantillons biologiques.

Pour cela, des kits de prélèvement stériles à usage unique ont été conçus afin d'éviter toutes contaminations entre les différents échantillons prélevés et tout risque potentiel de contamination du site. Après avoir testé différentes pratiques, les prélèvements consistent en un micro-carottage du bois permettant d'atteindre les zones à symptômes apparents, mais aussi les tissus touchés en profondeur sans symptômes externes indicateurs (précision sur l'appareillage disponible auprès de l'auteur).

Du laboratoire au terrain

Plan d'échantillonnage, les quatre catégories d'arbres

Le principal questionnement concernait donc le schéma de dissémination de l'agent pathogène dans des arbres porteurs, présentant ou non des symptômes. Pour répondre à cela, le choix du plan d'échantillonnage était primordial.

Les arbres ont été classés en quatre catégories suivant la progression de la maladie :

– I : arbre sain hors zone de contamination,

– II : arbre sain à proximité immédiate d'un arbre chancreux,

– III : arbre chancreux précocement diagnostiqué (sans autre symptôme qu'une nécrose sous corticale),

– I V : arbre chancreux avéré présentant des symptômes externes.

C. platani a été recherché sur des arbres appartenant à ces quatre catégories.

Pour les arbres de la catégorie I et II, les échantillons ont été prélevés aléatoirement à environ 10 cm et 70 cm de haut. Sur les arbres des catégories III et IV, des échantillons ont été prélevés au centre de la nécrose et/ou de la flamme, à la frontière entre la zone nécrosée et les tissus sains, ainsi que sur l'ensemble de la circonférence de l'arbre exempte de symptômes. Sur les arbres de catégorie III, des prélèvements d'échantillons de feuilles et de bourgeons complètent l'échantillonnage. Chaque arbre ainsi quadrillé nous permet de positionner la présence de C. platani.

Dans le cadre de cette étude, une détection précoce avant apparition de tout symptôme serait possible en cas de dissémination totale de l'agent pathogène, par exemple par une circulation dans la sève avant l'expression de la pathogénicité. Dans ce cas de figure, un échantillon contenant des tissus conducteurs, quel que soit l'endroit de prélèvement, pourrait apporter une réponse présence/absence. On aurait alors un réel outil de détection très précoce.

Résultat : un champignon présent en frontière de nécroses

Dans le cas du chancre coloré du platane, les analyses menées montrent que la présence de C. platani est strictement limitée à la frontière entre tissus sains et tissus nécrosés. La nécrose suit la progression du champignon. Aucune trace ADN de ce dernier n'est présente, ni dans les tissus anciennement atteints, ni dans ceux encore épargnés.

Cas de l'arbre positif sans symptômes

Néanmoins, sur l'ensemble des tests réalisés, un échantillon prélevé sur un arbre identifié comme sain après évaluation visuelle, s'est révélé positif.

Par la suite, le suivi des arbres utilisés nous a révélé que cet arbre était effectivement contaminé par C. platani. Mais l'infection était à un stade extrêmement précoce, et le prélèvement à l'aveugle s'est effectué sur une nécrose sous corticale. Soixante jours après, une recherche sous corticale a en effet révélé une veine nécrosée d'environ 15 cm de haut sur un demi centimètre de large contenant sur son trajet les stigmates du prélèvement.

Un bilan à deux faces

Un outil mobile, utilisable dès les premiers symptômes, et aux résultats rapides

La conception d'un outil de détection du chancre coloré du platane est très concluante au niveau technique.

Nous avons mis au point un outil répondant à l'ensemble du cahier des charges en termes d'efficacité, fiabilité et sensibilité. La technologie retenue nous permet le transport de l'outil sur le terrain.

De plus cela nous ouvre des perspectives de polyvalence en transposant cette technologie à la recherche d'autres pathogènes (champignons, bactéries, virus) sur d'autres espèces végétales, avec la possibilité avec un seul appareil de réaliser des analyses multiples en parallèle.

Mais le diagnostic avant tout symptôme reste illusoire

Mais, même si l'étude technique est une réussite, le problème de la détection très précoce du chancre coloré avant apparition de tout symptôme visuel demeure.

En effet, bien que le test discrimine la présence du champignon de son expression, les analyses réalisées nous révèlent que le champignon n'est présent que là où il s'exprime. Ainsi, du fait même de la biologie de C. platani, la probabilité de détection très précoce reste très faible à moins de multiplier les prélèvements permettant de reproduire un cas de figure comme celui commenté ci-dessus. Ce qui n'est pas réaliste !

De l'espoir dans les traitements ?

Un site utilisé pour de nouveaux tests

Un des sites de prélèvement comportait un arbre chancreux diagnostiqué en septembre 2010. En mars 2011, soit 6 mois après cette inspection, aucun arbre à proximité de cet arbre chancreux ne présentait de symptômes externes. Toutefois, une recherche sous corticale nous a permis de déceler 3 nouveaux arbres présentant des nécroses caractéristiques du chancre coloré néanmoins sans symptômes de « flamme ». Suite à la découverte de ces 3 nouveaux cas d'infection précoce, une zone de 7 arbres a été défi nie comme zone d'expérimentation (Figure 1). L'objectif était de proposer une méthode de traitement innovante contre le chancre coloré du platane.

Pourquoi des produits sont efficaces in vitro et pas dans les arbres

En effet, le manque d'efficacité des traitements testés jusqu'à aujourd'hui ne semble pas dû à l'inefficacité des substances actives, puisque certaines d'entre elles se révèlent efficaces in vitro sur C. platani.

Ce parasite affectionne particulièrement les rayons libéro-ligneux où il prospère et à partir desquels il peut s'enfoncer radialement dans le tronc. Le champignon peut ensuite gagner des vaisseaux du xylème et progresser longitudinalement.

Si les traitements ne fonctionnent pas, c'est parce que le champignon se situe en profondeur. Il faut que le fongicide surmonte diverses barrières physiques pour atteindre sa cible.

Idée : apporter le fongicide au contact du champignon

L'idée est donc de mettre le fongicide directement en contact avec sa cible, de façon localisée, précise, voire préventive.

Il faut l'introduire en profondeur, au minimum dans les premières assises du xylème, mais sans créer de nouvelle porte d'entrée pour les pathogènes.

La technique retenue a été celle de la micro-injection sans pression ni perçage préalable. Elle permet de maîtriser avec précision la localisation du point d'introduction du fongicide. Elle permet aussi de réduire drastiquement voire annuler tout phénomène de compartimentalisation.

La micro-injection d'un fongicide systémique autorisé en traitement des parties aériennes (dont fait partie le tronc) sur arbres et arbustes d'ornement (dont fait partie le platane) a été testée fin mars 2011.

Parmi les trois arbres chancreux détectés précocement, les n°2 et 3 ont été traités et le n°4 laissé comme témoin chancreux.

De même, le fongicide a été appliqué aux arbres sains n°1 et 6 tandis que l'arbre n°7 a été laissé comme témoin sain.

Aucun traitement n'a été réalisé sur l'arbre chancreux n°5 présentant un stade avancé de la maladie (figure 1).

Ces arbres ont ensuite fait l'objet d'une surveillance mensuelle pendant 13 mois.

Le suivi n'a pas pu avoir lieu sur une seconde année d'expérimentation suite à l'abattage des arbres initialement programmé.

Résultats préliminaires prometteurs

Bien que la période d'expérimentation soit restreinte de même que le nombre d'arbres traités, cet essai, test préliminaire, révèle des résultats étonnants et prometteurs.

Deux mois après traitement (figure 2A), les arbres chancreux non traités n°4 et 5 présentaient une densité foliaire de moindre importance que les arbres chancreux traités n°2 et 3. Ces derniers présentaient une densité foliaire similaire aux arbres sains n°1, 6 et 7.

Cette tendance se confirmait 3,5 mois après traitement (figure 2B). Les arbres chancreux n°4 et 5 montraient une faible densité foliaire, un jaunissement du feuillage et une chute prématurée des feuilles, symptômes plus marqués chez l'arbre n°5. Les arbres chancreux traités n°2 et 3 sont toujours, à ce niveau d'observation, non différenciables des arbres sains n°1, 6 et 7.

En tout début automne, 6 mois après traitement (figure 2C), les arbres chancreux n°4 et 5 sont totalement dépourvus de feuilles. On observe toujours un comportement identique entre les arbres chancreux traités n°2 et 3 et les arbres sains n°1, 6 et 7.

En avril 2012, les arbres de la zone étaient à un stade de débourrement voire premières feuilles, hormis l'arbre chancreux n°4 qui présentait un net retard dans le processus de débourrement et l'arbre chancreux n°5 qui ne présentait que quelques bourgeons.

Ce test préliminaire révèle, sur la durée de suivi, un comportement différent des trois arbres chancreux détectés précocement. Les deux arbres traités par micro-injection de fongicide, arbres n°2 et 3, présentent un comportement identique au point de vue foliaire aux arbres sains.

L'arbre témoin chancreux, arbre n°4, se comporte quant à lui de façon similaire, même si moins marqué, à l'arbre chancreux n°5 à l'origine du foyer chancreux.

Progression des nécroses

En plus du suivi de la vigueur et de la densité foliaire des arbres, la progression des nécroses sous corticales a été régulièrement contrôlée.

Ainsi sur l'arbre témoin chancreux n°4, on a mesuré de mars à septembre 2011 une progression de la nécrose en hauteur de 135 cm (figure 3A). En mars 2012, on constatait l'apparition d'une flamme colorée débutant à environ 1 m de hauteur et atteignant les premières charpentières quasiment à l'opposé du point d'apparition de la nécrose (figure 3).

Sur les arbres chancreux traités par micro-injection de fongicide n°2 et 3, un net ralentissement de la progression de la nécrose est observé, mesurant respectivement 30 cm et 40 cm en fin d'expérimentation.

Sur les coupes transversales réalisées sur ces arbres lors de leur destruction, aucune trace de C. platani au-delà de 80 cm de haut n'a été détectée. De plus, ces coupes montrent que le champignon ne s'est pas enfoncé en profondeur mais est resté localisé dans les 4 premiers centimètres, contrairement au cas de l'arbre témoin chancreux n° 4 (Figure 3B).

Conclusion

Il s'agissait là d'un test préliminaire restreint par le nombre d'arbres, les délais d'observations et différentes contraintes de mise en oeuvre. Bien qu'il ne se soit déroulé que sur 13 mois, ce test fait entrevoir des perspectives prometteuses dans la maîtrise du champignon Ceratocystis platani agent du chancre coloré du platane.

Ce travail nous a de plus permis d'acquérir de nombreuses informations quant à la faisabilité d'une expérimentation à plus grande échelle en mettant en lumière les différents points d'optimisation nécessaires à apporter pour une réussite à venir.

Malheureusement, aujourd'hui, le problème majeur de l'expérimentation en ZNA, notamment sur arbres (marronniers, pins et, donc, platanes), réside dans la recherche et mise à disponibilité de sites expérimentaux. À l'heure actuelle, ce manque de sites est un réel frein à la recherche appliquée en phytopathologie sur ces espèces, tandis que la recherche fondamentale connaît des avancées intéressantes.

Concernant le platane, face aux chancre coloré, l'enjeu n'est plus de défendre son intérêt à titre individuel, mais aujourd'hui de regrouper l'ensemble des acteurs pour progresser sur le sujet et sauver un patrimoine arboré exceptionnel.

Ce test montre qu'il y a des pistes à suivre concernant la maîtrise de la maladie... il reste à les explorer.