Imprimer
1. Méristème isolé sur milieu de régénération MS (1962), première semaine après la mise en culture. On observe le début de la régénération : chez le sémillon, elle commence toujours par la formation d'une grande feuille.
2. Méristème isolé sur le même milieu de régénération, deux semaines après la mise en culture. La première feuille a grandi.
3. Méristèmes isolés sur le même milieu, au même moment. On voit la formation de cette feuille chez tous les méristèmes.
4. Suite de la régénération 6 semaines après mise en culture ; à côté de la première feuille, d'autres se sont différenciées ; à partir de ce stade, la plantule est transférable sur milieu Galzy.
5. Plants avec des racines, prêts pour le transfert in vivo.
6. Et voilà les plants acclimatés. Photos : Mercier Novatech
La collection de sémillon blanc sélectionnée par Denis Dubourdieu pour la qualité gustative des raisins de ces vignes et multipliée par les Pépinières Mercier est un exemple de matériel végétal diversifié à partir d'une sélection massale et assaini par un travail sanitaire particulier.
Une démarche intéressante pour enrichir la biodiversité des cépages viticoles sans risque sanitaire.
Pourquoi assainir
Biodiversité du matériel végétal, pourquoi ?
L'appauvrissement de la biodiversité est un constat souvent évoqué dans le domaine de la production de matériel végétal. En réponse à une offre de production clonale parfois limitée ou ne répondant plus tout à fait aux exigences actuelles, de plus en plus de viticulteurs souhaitent augmenter la biodiversité dans leur vignoble. Pour cela, il faut remettre en lumière de vieilles vignes ou des variétés anciennes par la sélection massale et sanitaire.
Avant qu'ils ne disparaissent, il est utile de multiplier des ceps qui répondraient aux exigences de la viticulture à venir, par exemple une vigueur moindre, une meilleure résistance aux pathogènes ou une adaptabilité aux changements climatiques.
Assainir ces réservoirs de biodiversité, une nécessité
Cependant, la multiplication de la vigne est soumise à des normes strictes, établies pour limiter la propagation des maladies virales. Après des années de mise en œuvre du système de certification, la majorité des variétés de vigne en vente sur le marché aujourd'hui est indemne des virus les plus préjudiciables. Avant de multiplier de vieux individus, potentiellement porteurs de virus, leur statut sanitaire est donc recherché.
Il s'avère hélas que l'effectif de plants sains dans la population sélectionnée est, le plus souvent, insuffisant.
Afin de préserver ce matériel ancien, l'utilisation de méthodes d'assainissement est souvent indispensable pour éliminer les virus détectés. Ces méthodes, appliquées correctement, permettent de régénérer de nombreuses variétés, condamnées sans cela à la disparition.
Le cas du sémillon blanc
7 et 77 clones
Le sémillon, cépage blanc originaire du Bordelais et plus particulièrement du vignoble de Sauternes, permet d'élaborer des vins blancs secs de grande qualité, surtout des moelleux et, grâce à la pourriture noble, des liquoreux réputés. Sa vigueur est moyenne et il est assez productif.
Dans les années 1960, 7 clones ont été sélectionnés et enregistrés au catalogue des variétés disponibles. Actuellement, deux collections d'environ 70 clones sont en cours d'observation en Gironde.
Des virus présents au départ
Un grand nombre de plants sélectionnés se sont avérés infectés par les virus du court-noué et/ou par celui de l'enroulement 2. L'assainissement de ce matériel s'est alors imposé.
Deux méthodes d'assainissement peuvent être appliquées : la régénération à partir de méristèmes et la thermothérapie. Ces deux méthodes sont connues pour être efficaces pour se libérer de nombreux virus (Valero et al., 2003 ; Botallico et al., 2003). Le travail réalisé par l'équipe du laboratoire Mercier Novatech montre que l'association des deux méthodes peut être plus efficace pour l'élimination des virus rencontrés.
Choix des plants et évaluation de leur état sanitaire
Vieilles vignes et analyses modernes
Des plants de sémillon ont été sélectionnés dans diverses parcelles de vieilles vignes bordelaises. Ce matériel végétal a été testé selon la méthode DAS-ELISA (méthode officielle du LNPV VV/04/05, version b). Les viroses principales ont été recherchées, à savoir :
– les deux virus responsables de la maladie du court-noué, ArMV et GFLV,
– trois sérotypes des virus de l'enroulement : GLRaV-1, GLRaV-2 et GLRaV-3.
Les analyses sanitaires ont mis en évidence la présence des deux virus du court-noué, les échantillons s'étant montrés positifs en GFLV mais aussi en ArMV. Ils étaient également positifs en GLRaV-2 (sérotype 2 de l'enroulement).
Ce matériel sélectionné devait être assaini avant de pouvoir en réaliser les évaluations agronomiques.
Des plants ont été préparés à partir des greffons récoltés sur les vieilles vignes et greffés sur des porte-greffes sains. Ces greffés- soudés ont ensuite servi de source pour effectuer les premières mises en culture in vitro. Deux méthodes d'assainissement, en rapport direct avec la spécificité physiologique de chaque virus détecté, ont été envisagées : la thermothérapie (visant le GFLV et l'ArMV) et la régénération à partir de méristèmes (visant le GLRaV-2).
Méthodes d'assainissement testées
La thermothérapie, en général
La thermothérapie est une méthode basée sur l'inhibition de la multiplication virale dans la plante en la maintenant à une température supérieure à 30 °C. Elle diffère du traitement à l'eau chaude des plants, visant les maladies du bois et parfois qualifié lui aussi de thermothérapie.
En général, la température de 37 °C en phase éclairée (35 °C en phase obscure) est appliquée aux plants durant plusieurs semaines. La thermothérapie, seule, n'est pas une méthode d'assainissement suffisante ; il faut l'associer à un bouturage du sommet de la plante – dans notre cas, à la régénération à partir de méristèmes.
Son rôle principal est de ralentir la progression du virus dans la plante, permettant ainsi une concentration dégressive du virus vers la zone apicale du rameau où se situe le méristème (Blanc et al., 1999). La croissance active de la plante durant la thermothérapie est la clef de la réussite.
La régénération à partir de méristèmes, en général
La régénération à partir de méristèmes in vitro est une méthode d'assainissement, utilisant le microbouturage pour reconstruire une plante saine à partir d'une plante virosée. Cette étape a lieu in vitro sur des milieux contenant des hormones (auxine et cytokinine).
La taille du méristème isolé est essentielle pour ne pas prélever de virus. En général, plus elle est petite, plus les risques de prélever des tissus virosés sont faibles mais moins la régénération aboutit à une structure viable. Un diamètre de 0,3 - 0,5 mm est suffisant pour éliminer la majorité des virus.
Application des deux méthodes sur sémillon : préparation des vitroplants avant assainissement
Des pieds-mères, maintenus en serre protégée, ont été utilisés, d'une part pour mettre en culture des boutures in vitro et, d'autre part, pour prélever directement des méristèmes.
Avant leur introduction in vitro, les fragments sont désinfectés dans une solution javellisée. La durée du bain (entre 5 et 15 minutes maximum) est adaptée selon la fragilité du matériel végétal. La désinfection est complétée par trois rinçages à l'eau désionisée stérile.
Les microboutures ont été cultivées sur un milieu Knop modifié par Galzy (1964), sans hormone, enrichi de 25 mg/L de vitamine C, 100 mg/L de Myo-Inositol, 20 g/L de saccharose et 7 mg/L d'agar. Le pH a été ajusté à 6,5 avant autoclavage.
Il faut un premier cycle de multiplication entre l'introduction in vitro et l'assainissement pour disposer de vitroplants homogènes et en pleine croissance.
Ces vitroplants ont été, soit installés en caisson de thermothérapie, soit utilisés directement pour le prélèvement des méristèmes apicaux de 0,3 – 0,5 mm (à la loupe binoculaire au grossissement x40).
Opérations d'assainissement, avec les deux techniques
Pour la régénération simple à partir de méristèmes, deux types de prélèvements ont été testés : l'un effectué sur les vitroplants en croissance et l'autre effectué directement sur les plants-mères en serre.
Les méristèmes isolés ont été régénérés sur milieu Murashige & Skoog (1962), enrichi en hormones. Les cultures établies ont été maintenues à une température de 21 ± 2 °C avec une photopériode de 16 heures (lumière)/8 heures (obscurité).
Des tubes fluorescents diffusant environ 2 000 lux au niveau des cultures ont été utilisés. Pour les besoins de nos essais, environ dix méristèmes par accession disponible ont été prélevés.
Pour la thermothérapie, seuls les vitroplants en croissance active, ayant subi au moins un cycle de multiplication, ont été exposés au traitement par la chaleur à 38 °C (pendant les 16 heures d'éclairement à 2 000 lux) et à 36 °C (pendant les 8 heures d'obscurité) durant 6 semaines environ.
La multiplication de certains virus étant inhibée par la chaleur, des méristèmes jusqu'à 0,5 - 1,0 mm (donc plus grands que de coutume) ont pu être prélevés, augmentant ainsi leurs chances de régénérer. Cinq méristèmes au maximum ont été isolés à partir de chaque accession disponible.
Chacun des méristèmes régénérés a été codé et multiplié séparément avant d'être transféré in vivo.
La présence de virus a été vérifiée par DASELISA, sur les explants in vitro, ainsi que sur les rameaux aoûtés.
Résultats obtenus
Combinaison des méthodes : un meilleur taux de régénération…
Le Tableau 1 montre les taux de régénération obtenus en fonction de la méthode choisie, ainsi que les taux d'assainissement tels qu'évalués immédiatement.
Le plus mauvais taux de régénération a été obtenu avec la méthode de régénération de méristèmes prélevés directement sur les plantes mères en serre : 17 % de plants régénérés. Il est probable que la plus grande concentration de virus dans les plantes en soit la cause.
La méthode de régénération directe à partir d'explants in vitro a permis d'obtenir un score légèrement meilleur, augmentant le taux de régénération de 17 à 27 %. Dans ce cas-là, il reflète exactement la situation peu satisfaisante concernant l'assainissement des plants vis-à-vis du virus GFLV, car aucun plant régénéré ainsi n'a été assaini !
Le taux de régénération démontre ainsi clairement un lien entre la régénération obtenue et l'échec de cette méthode vis-à-vis du court-noué.
De même, le taux de régénération élevé observé pour la méthode combinée (80 % de plants régénérés par cette méthode) laisse soupçonner une réussite plus élevée concernant l'assainissement de ce virus.
Et un assainissement très satisfaisant
Cela a été confirmé par les tests DAS-ELISA effectués sur vitroplants (Tableau 1).
Il en a été de même sur les plants transférés in vivo depuis plus de six mois (Figure 1) : au moment de l'aoûtement, plus de 95 % de plants effectivement assainis vis-à-vis du virus GFLV et 100 % de plants sains vis-à-vis des virus ArMV et GLRaV-2.
Logique respectée
Chaque technique touche « ses » virus
Ces résultats sont liés à la physiologie des virus traités. En effet, les virus de l'enroulement seraient incapables de contaminer les tissus près du méristème apical comme peuvent le faire les népovirus (court-noué). C'est pourquoi, dans notre cas, le GLRaV-2 a pu être supprimé par la régénération simple à partir de méristèmes. À l'inverse, les GFLV et ArMV, virus du court-noué sensibles à la chaleur, ont dû être exposés à la thermothérapie pour permettre une croissance des cellules apicales plus rapide que la progression du virus dans la plante. Sans application de la thermothérapie, qui inhibe la multiplication de ces virus, l'élimination des népovirus semble très difficile.
Le même résultat a été obtenu par Valero et al., (2003). Il a confirmé que le prétraitement par la chaleur est une condition importante pour réussir l'élimination de GFLV. Cependant, contrairement à nos résultats, Bottalico et al., (2003) mentionnent que le virus GFLV peut être éliminé avec succès par régénération simple à partir de méristèmes apicaux ; mais ils reconnaissent que le traitement thermique augmente le nombre de plantes indemnes de GFLV.
Tests ELISA, confirmés après huit mois
En ce qui concerne les analyses DAS-ELISA, il peut être intéressant de mentionner qu'elles se sont, dès le stade in vitro, révélées très fiables. Leurs résultats ont été confirmés sur le matériel aoûté, 8 mois plus tard. Ce fait permettra de connaître le statut viral d'une régénération et d'éviter de la multiplier in vitro.
Virus, le GLRaV-2 inhibe les plantules
Sur la base d'observations, il a été noté que la croissance de la culture primaire in vitro semble affectée négativement par la présence des virus dans la plante. La présence de GFLV ou ArMV a simplement induit une déformation des feuilles et une forme de « vitrification », mais la présence de GLRaV-2 a probablement inhibé tout le développement des explants et a causé leur mort précipitée, surtout après remultiplication du matériel in vitro.
Cette hypothèse est suggérée par la croissance améliorée observée après la régénération qui a permis l'assainissement du virus GLRaV-2. C'est pourquoi il peut être intéressant, dans le cas de contamination avec l'enroulement, de rétablir des cultures primaires à partir des méristèmes avant d'exposer les plants à la thermothérapie, avec pour but d'augmenter la qualité de la croissance durant le traitement.
Conclusion : outil moderne pour variétés anciennes
Les méthodes d'assainissement ont été employées dans le cadre de la sélection clonale du cépage sémillon. Aucun dysfonctionnement majeur lié à la culture in vitro n'a été enregistré, ni pendant la croissance sur les milieux utilisés, ni pendant la régénération – ce qui laisse supposer une variété plutôt facilement cultivable in vitro.
Cependant, la simple régénération à partir de méristèmes apicaux, pourtant si prometteuse vis-à-vis de l'enroulement 2, s'est avérée inefficace pour supprimer les virus du court-noué. La méthode de régénération a dû être combinée avec la thermothérapie, créant une association beaucoup plus efficace qui a permis d'obtenir 95 % de plantes sans virus GFLV et/ou ArMV, contre 0 % pour la méthode simple.
Sur la base de ces résultats, dans le cas où l'état sanitaire des plantes n'est pas toujours connu, il peut être judicieux d'appliquer une méthode combinée, associant le traitement par chaleur avec la régénération à partir de méristèmes apicaux.
Cette combinaison de méthodes, innovante, très efficace en terme d'élimination des virus, pourrait permettre de lever des freins techniques à la préservation ou à la remise au goût du jour de variétés anciennes et oubliées (cf : Projet Wine Mosaïc).
Virus recherchés dans ce travail, de quoi s'agit-il ?
Les viroses principales de la vigne sont :
– la maladie du court-noué, qui associe en Europe centrale et en Europe de l'Ouest deux virus : Arabis mosaic virus (ArMV) et Grapevine fanleaf virus (GFlV) (Schellenberger et al., 2009),
– trois sérotypes des virus de l'enroulement : GLRaV-1, GLRaV-2 et GLRaV-3.
Ces virus sont responsables de pertes importantes de récoltes. Le court-noué, la plus virulente des maladies virales de la vigne (Cepin et al., 2009), entraîne une réduction de la vigueur de la vigne et, à terme, sa dégénérescence complète. Quant à l'enroulement, il induit une réduction de la concentration en sucres dans le raisin (Legorburu et al., 2009 ; Walter & Martelli, 1997).
Ces virus ont des forces et faiblesses.
Ainsi, les Népovirus responsables du court-noué (GFLV et ArMV) sont thermosensibles : ils se multiplient de moins en moins à des températures supérieures à 30 °C si appliquées plusieurs semaines. Par ailleurs, ils sont capables d'infecter les tissus très près du méristème ce qui peut rendre inefficace la régénération directe à partir de ces structures.
Pour le virus de l'enroulement (GLRaV-2), c'est l'inverse : il n'est pas thermosensible, mais, distribué de façon hétérogène dans la plante, il est incapable d'infecter les tissus près du méristème.
Fig. 1 : Assainissement : verdict après six mois.
Comparaison des taux de réussite pour les trois méthodes d'assainissement, sur les plants aoûtés (plus de 6 mois après leur transfert in vivo).
Tableau 1 : Effet de la méthode d'assainissement sur le taux de régénération et l'élimination des virus détectés
