Face à l'impasse de la lutte chimique contre la rouille blanche, des solutions prometteuses ont été développées dans le cadre de plusieurs projets menés au sein d'Astredhor, l'institut technique de l'horticulture.

Trois nouvelles approches ont été étudiées pour trouver des solutions durables contre la rouille blanche, dont les deux premières ont été réalisées sous financement CTPS-DGAL :

- le développement d'un outil pour aider les obtenteurs à identifier la résistance variétale et améliorer leurs obtentions ;

- la mise au point d'un outil de détection précoce et sensible du pathogène de la rouille blanche ;

- l'homologation d'un SDP (stimulateur de défenses des plantes) très efficace, fruit de l'expérimentation sur ces substances.

Mieux comprendre la rouille blanche

Symptômes et origine

La rouille blanche est l'une des maladies les plus redoutées en culture de chrysanthème (pour plantes en pots ou fleurs coupées). Cette maladie fongique grave est causée par Puccinia horiana Hennings.

Les symptômes se manifestent sur la face supérieure des feuilles sous la forme de petites taches blanchâtres, légèrement déprimées. Des pustules jaunâtres sont visibles sur la face inférieure des feuilles : les plantes deviennent alors invendables. La rouille blanche peut entraîner la perte totale de la culture si les plantes infestées ne sont pas repérées et détruites rapidement et si le reste de la culture n'est pas traité.

Aujourd'hui, le pathogène Puccinia horiana Hennings est répandu sur presque tous les continents. Les spores de ce parasite obligatoire strict se propagent facilement si les températures jour/nuit sont fluctuantes, l'humidité est élevée (80-100 % durant au moins 3 heures) et le feuillage humide.

Jeunes plants en quarantaine : lutte en production de plantes fleuries

La rouille blanche est inscrite sur la liste A2 de l'OEPP. En cas de contamination, les mesures de quarantaine concernent la production de jeunes plants destinés aux horticulteurs, les producteurs de plantes fleuries sont obligés de traiter.

Ils luttent en réalisant des traitements récurrents préventifs et curatifs en alternant les matières actives (mancozèbe, krésoxim-méthyl, myclobutanil). Le nombre de traitements peut atteindre huit à douze en période sensible (août-septembre). Mais plusieurs fongicides classiques, même en alternance, ne semblent plus efficaces aujourd'hui.

Le jeune plant issu de bouture est souvent à l'origine de l'infestation des productions (Astredhor, 2010). Les plants infestés paraissent sains jusqu'au moment où les conditions climatiques deviennent favorables au pathogène.

Pour réduire les risques de contamination, des pratiques sont conseillées : variétés plus résistantes, choix de producteurs de jeunes plants réputés sains renommés, réduction de la densité des plantes par mètre carré, limitation des arrosages en aspersion, conduite d'une culture sèche ou encore réduction de l'hygrométrie dans les abris.

La sensibilité des variétés évaluée par un test biologique

Constitution d'une collection de souches de rouille blanche

La première tâche du projet a consisté à recueillir des échantillons de rouille blanche sur plantes, entre 2012 et 2014, afin de constituer une collection de souches.

Les échantillons prélevés sur le territoire national par les conseillers ont été centralisés par la station Stepp et le GIE Fleurs et Plantes avant l'envoi au partenaire Vegenov pour conservation. Les souches ont ensuite été envoyées au Geves-Snes pour mise en collection.

Cette action a permis la constitution d'une collection de souches de rouille blanche du chrysanthème : 44 souches recueillies sur le territoire français et 12 souches étrangères (Angleterre, Belgique, Pays-Bas et Japon) fournies par le Dr Kurt Heungens, chercheur à l'Ilvo - Unit Plant - Crop Protection, Merelbeke, Belgique.

Étude des populations de rouille blanche sur un panel de 25 variétés

Afin de mieux connaître la diversité comportementale des souches et variétés, quatre essais ont été menés par Vegenov en conditions contrôlées, en collaboration avec la station Stepp et le GIE Fleurs et Plantes.

Un panel de 25 variétés de chrysanthème a été évalué afin de connaître le niveau de résistance/sensibilité face à une gamme de 29 souches de rouille blanche (dont 12 souches étrangères).

Le test de résistance/sensibilité consiste à déposer des feuilles présentant des symptômes matures de rouille blanche au-dessus des plantes à infester.

Quatorze à dix-neuf jours après inoculation, le niveau d'infection des variétés de chrysanthème par la rouille blanche est évalué grâce à une échelle de notations (Figure 1) allant de 0 (plant non infecté) à 4 (plant très fortement infecté).

Une variété est classée « tolérante » à la rouille blanche si la note moyenne d'indice maladie est inférieure ou égale à 1,5. Une variété est considérée comme « sensible » lorsque la note moyenne d'indice maladie est strictement supérieure à 1,5.

Agressivité des souches de la rouille blanche selon l'origine géographique

La dispersion des notes d'indice maladie induites par les différentes souches de rouille blanche vis-à-vis des 25 variétés de chrysanthème est relativement homogène (Figure 2). En effet, toutes les souches sont capables d'induire ou non la maladie en fonction de la variété évaluée, avec des notes allant de 0 à 4 pour 25 souches/29.

En regardant plus en détail, les souches de rouille blanche évaluées ont des différences comportementales en fonction des variétés. En effet, certaines seront majoritairement peu agressives (Figure 2, souches CWR.13AG à CWR.13AC), alors que d'autres sont majoritairement agressives (Figure 1, souches CWR.13AN à CWR.13I).

Parmi les souches évaluées, les souches étrangères (signalées dans la Figure 2 par des astérisques) semblent globalement plus agressives que les souches françaises. En effet, la majorité des valeurs médianes d'infection induites par les souches étrangères est comprise entre 2 et 2,7 contre 0,3 et 1,3 pour les souches françaises.

Parmi les souches françaises, la différence d'agressivité entres souches ne semble pas corrélée à la région de prélèvement.

Sensibilité des variétés de chrysanthème à la rouille blanche

Le comportement des variétés de chrysanthème semble variable en fonction des souches de rouille blanche évaluées.

Trois variétés (codées W, X et Y) ont montré une sensibilité à l'ensemble des souches et quatre variétés (A, B, C, D) sont tolérantes aux 29 souches de rouille blanche. Les variétés N et O sont intermédiaires et s'avèrent très sensibles à très résistantes selon les souches. Les variétés F et G, quant à elles, sont résistantes à la quasi-totalité des souches mais présentent pourtant une très forte sensibilité à deux souches.

Sur les 25 variétés évaluées, 15 semblent avoir la même sensibilité aux souches étrangères et aux souches françaises (moins de 20 % d'écart en termes d'agressivité).

Parmi les dix variétés de chrysanthème présentant des niveaux de sensibilité variables en fonction de l'origine des souches, neuf variétés sont plus sensibles aux souches étrangères, tandis qu'une variété est plus sensible aux souches françaises. Ces résultats sont représentés Figure 3.

Conclusions et perspectives

Toutes les souches de rouille blanche étudiées peuvent induire ou non des symptômes en fonction des variétés, même si des variations de niveau d'agressivité peuvent être observées.

Parmi les vingt-neuf souches collectées, douze sont d'origine étrangère et semblent plus agressives que les souches françaises.

Concernant le comportement des variétés, ces dernières ont présenté de grandes différences de comportement selon les souches étudiées.

En effet, si certaines étaient résistantes ou sensibles à toutes les souches, la plupart présentent des comportements s'échelonnant de « résistant » à « sensible » en fonction des souches testées.

Ce travail pourrait donc être poursuivi sur un plus grand nombre de souches de rouille blanche et de variétés de chrysanthème, afin notamment d'approfondir l'importance de l'origine géographique des souches.

Une caractérisation génétique des souches de rouille blanche permettrait également de mieux comprendre les différences de comportements et d'agressivité des souches.

Détection précoce de la rouille blanche du chrysanthème

Un test moléculaire élaboré

Depuis quelques années, l'évolution des outils de biologie moléculaire, notamment les techniques basées sur la PCR (réaction de polymérisation en chaîne ou Polymerase Chain Reaction), ont permis des avancées importantes dans la détection des agents pathogènes des végétaux.

La PCR est une technique permettant d'obtenir, à partir d'un échantillon d'ADN, d'importantes quantités d'une séquence d'ADN spécifique. La détection d'un agent pathogène se fait par amplification exponentielle d'une séquence spécifique du génome de l'agent pathogène recherché.

Cette amplification se fait grâce à l'enzyme Taq Polymerase et à des amorces complémentaires de la séquence cible de l'agent pathogène. La révélation se fait par suivi de fluorescence en temps réel au cours de l'amplification de la séquence cible (analyse quantitative).

Dans le cadre d'un projet collaboratif porté par Astredhor, un test de détection moléculaire de Puccinia horiana, l'agent pathogène responsable de la rouille blanche du chrysanthème, a été mis au point et validé en conditions de laboratoire. La méthode de détection a été validée dans un test interlaboratoire (« ring-test ») organisé par le Geves et avec Vegenov.

Ce test est basé sur l'utilisation d'un marqueur moléculaire reconnaissant une région spécifique de l'ADN ribosomique de Puccinia horiana (Figure 4) adapté d'Alaei et al., (2008). Les différentes étapes nécessaires à la détection moléculaire de Puccinia horiana dans un échantillon de feuille de chrysanthème sont décrites dans la Figure 5.

Vérification des performances du test

Afin de vérifier la détection spécifique uniquement de Puccinia horiana avec le test moléculaire développé, les partenaires du projet ont utilisé ce test sur un panel de souches de Puccinia horiana et sur des souches d'autres espèces de rouilles (jaune, brune et couronnée) appartenant toutes au genre Puccinia.

Seules les souches de rouille blanche ont été ciblées par le marqueur moléculaire mis au point. Aucune des trois autres espèces de rouille n'a été ni amplifiée et ni détectée (Figure 6).

Afin de déterminer la taille de l'échantillon maximale analysable sans risque d'obtenir des faux négatifs (c'est-à-dire de ne pas détecter la rouille blanche dans l'échantillon alors qu'elle est réellement présente), une pustule de rouille blanche a été mélangée à un volume croissant de matériel foliaire sain de chrysanthème, soit 10, 25, 50, 100 et 200 grammes de feuilles saines. Les résultats ont montré la détection moléculaire de Pucciana horiana jusqu'à 200 grammes de feuilles saines de chrysanthème en mélange, à partir d'une seule et unique pustule.

Pour s'assurer de la validité des résultats obtenus avec ce test de détection précoce, des témoins sont inclus et analysés en même temps que les échantillons : un témoin négatif (de l'eau), un témoin peu contaminé et un ADN en limite de détection.

Conclusion : un test bientôt utilisable

Ce test de détection moléculaire de Puccinia horiana offre donc des perspectives très intéressantes pour la détection de cet agent pathogène, de manière non destructive et précoce, avant apparition des symptômes sur plants de chrysanthème.

Efficacité prouvée d'un SDP sur le terrain

Test réalisé sur une variété très sensible

Dans le cadre de cet essai portant sur l'efficacité d'un SDP, une variété connue pour sa sensibilité à la rouille blanche est utilisée : Dendranthema × grandiflorum var. 'Yahou Golden Yellow'.

Des plantes infestées ont été introduites dans les parcelles un jour avant le quatrième traitement. Ces plantes infestées sont placées dans les parcelles et redistribuées tous les 4-5 jours pour limiter une variabilité de pression parasitaire interbloc. Les plantes inoculatrices sont enlevées avant chaque traitement, puis réintroduites dans les parcelles après traitement.

Lors des trois dates de notations, les vingt feuilles portant les symptômes les plus sévères sont enlevées de chaque parcelle élémentaire et le nombre de taches blanches et de pustules par feuille est noté. Les données sont transformées en Ln (n + 1) et analysées par date de récolte avec le logiciel Statbox Pro v 7.1 (Anova et Test Newman-Keuls, p < 0,05).

L'essai a été effectué en quatre répétitions en randomisation totale pour les six modalités de traitement. Les modalités évaluées sont :

- témoin eau, cinq traitements à sept jours d'intervalle ;

- Inssimo (50 % Acibenzolar-S-Méthyl, ASM) à 0,05 g/l, cinq traitements à sept jours d'intervalle ;

- AG2, produit codé contenant du phosphite, dose 6,25 g/l, cinq traitements à sept jours d'intervalle ;

- itinéraire de traitement IT1, cinq traitements à sept jours d'intervalle. Première application : mancozèbe (75 %) à 2 g/l, Deuxième application : difenoconazole (250 g/l) à 0,5 ml/l, troisième application : mancozèbe (75 %) à 2 g/l, quatrième application : myclobutanil (45 g/l) à 1,66 ml/l, cinquième application : mancozèbe (75 %) à 2 g/l ;

- itinéraire de traitement IT2, cinq traitements à sept jours d'intervalle. Première application : AG2 (6,25 g/l), deuxième application : mancozèbe (75%) à 2 g/l, troisième application : difenoconazole (250 g/l) à 0,5 ml/l, quatrième application : myclobutanil (45 g/l) à 1,66 ml/l, cinquième application : AG2 (6,25 g/l) ;

- itinéraire de traitement IT3, cinq traitements à sept jours d'intervalle. Première application : AG2 (6,25 g/l), deuxième application : difenoconazole (250 g/l) à 0,5 ml/l, troisième application : AG2 (6,25 g/l), quatrième application : mancozèbe (75 %) à 2 g/l, cinquième application : AG2 (6,25 g/l).

Résultats probants

Vingt-cinq jours après introduction de l'inoculum, dans les parcelles traitées à ASM (Acibenzolar-S-Méthyl), l'intensité des symptômes est significativement plus basse par rapport aux autres modalités de traitement évaluées (Figure 7).

L'expression des symptômes, dans les parcelles des itinéraires de traitement AG2, IT1, IT2 et IT3, est aussi significativement moins importante que celle observée dans la modalité témoin eau, mais elle est, par ailleurs, significativement plus élevée que celle suivant le traitement ASM. Aucun symptôme de phytotoxicité n'est constaté avec les produits évalués.

L'expérimentation montre bien l'efficacité importante et durable de l'ASM lorsque les plantes sont traitées à cinq reprises à sept jours d'intervalle contre la rouille blanche du chrysanthème.

Vérification sur d'autres variétés

D'autres expérimentations menées par Astredhor montrent également que l'efficacité n'est pas « variété spécifique » (Stapel et al., 2015), c'est-à-dire dépendante de la variété, un phénomène pourtant souvent observé avec les SDP (Elicitra, 2013).

L'incidence et l'intensité des symptômes dans les cultures traitées avec ASM sont très faibles par rapport aux parcelles traitées avec d'autres produits.

Le traitement avec ASM révèle un mode d'action uniquement indirect. En effet, les tests sur les effets fongicides effectués par Vegenov montrent une germination des basidiospores peu impactée, même avec une dose très forte du produit (Stapel et Guerrand, 2012).

ASM est donc un stimulateur de défenses des plantes (SDP) induisant au sein de la plante des défenses physiques et/ou chimiques efficaces contre P. horiana dont les mécanismes restent à préciser.

L'utilisation d'ASM semble donner une durée de protection assez importante, même un mois après le dernier traitement.

Toutefois, au-delà d'un mois, la détermination de la durée d'efficacité devient délicate car le changement physiologique de la plante rend le chrysanthème aussi moins sensible à la rouille. Par exemple, au stade génératif (apparition des boutons floraux), les feuilles sont plus durcies et donc moins sensibles à la rouille blanche.

À la suite des essais menés à partir de 2009 par Astredhor, ASM est depuis juillet 2012 homologué pour un usage en productions ornementales contre la rouille blanche du chrysanthème (spécialité Inssimo, 50 % Acibenzolar-S-Methyl). Ce SDP permet d'obtenir une protection très élevée contre P. horiana et potentiellement de diminuer considérablement les IFT dans les cultures de chrysanthème.

Des opportunités intéressantes sont en cours d'évaluation concernant l'application d'Inssimo dans les cultures de multiplication pour protéger durablement les végétaux, de la bouture jusqu'à la plante fleurie prête à la commercialisation.