Présentation et validation d'un outil de diagnostic simple et rapide pour déceler la flavescence dorée directement sur site, à proximité des vignobles.

La flavescence dorée, jaunisse due au phytoplasme Candidatus phytoplasma vitis, occasionne d'importantes pertes dans le vignoble français. Aucun traitement curatif n'existe. L'arrachage des ceps atteints est obligatoire.

Comment être sûr qu'un cep est contaminé et qu'on ne l'arrachera pas à tort ? Il faut l'analyser. Peut-on le faire sur le terrain ? Maintenant, oui.

Un diagnostic nécessaire

La maladie et son vecteur

Rappelons que l'arrachage des ceps atteints est obligatoire parce que la flavescence dorée (FD) est classée maladie de quarantaine et de lutte obligatoire en France.

La maladie est propagée par la cicadelle Scaphoideus titanus. En France, cet insecte a d'abord été détecté en Languedoc-Roussillon, Aquitaine et Midi-Pyrénées, puis il est remonté dans des vignobles plus septentrionaux (Bourgogne...). Sa progression vers le nord et l'est est très significative.

Détection : le symptôme ne suffit pas

Les principaux symptômes de la maladie sont une décoloration des feuilles (jaune sur les cépages blancs et rouge sur les cépages noirs, voir photo 1), un défaut d'aoûtement, un flétrissement des baies et une mortalité précoce des inflorescences. Mais il est vain de se contenter de l'examen visuel pour identifier la maladie, pour trois raisons.

Tout d'abord, les symptômes ne sont pas visibles la première année d'infection. Des ceps asymptomatiques peuvent donc être porteurs du phytoplasme.

Ensuite, certains de ces symptômes peuvent être induits par d'autres pathogènes. C'est le cas des agents des maladies du bois (ex. : esca) et du phytoplasme responsable du bois noir (BN), Candidatus phytoplasma solani. Le bois noir cause des symptômes similaires à la flavescence dorée mais n'est pas une maladie de quarantaine. En effet, il induit une dégénérescence des plantes bien plus lente que celle due à la flavescence dorée. Enfin, certaines carences minérales et des cassures de rameaux peuvent induire des doutes lors de la prospection.

Le laboratoire, passage obligé

Techniquement parlant, le seul moyen de confirmer la présence du phytoplasme de la flavescence dorée Ca. P. vitis est donc de réaliser une analyse.

Légalement parlant, la DGAL (Direction générale de l'alimentation), qui a défini les modalités de la surveillance de la maladie, a rendu obligatoire de confirmer toute détection de symptômes par une identification au moyen de la méthode officielle MOA 006 version 2b. Celle-ci est réalisable uniquement en laboratoire.

Aujourd'hui, seuls quelques laboratoires sont accrédités en France pour ce type d'analyse. Il faut acheminer les échantillons au laboratoire, puis le délai de fourniture des résultats est d'au moins une journée après réception des échantillons. Aucun moyen de détection rapide, au champ, n'existait.

Vers un kit de détection rapide

Un test de détection de l'ADN

Anova-Plus, société installée sur le biocluster Genopole, a développé à partir de sa technologie Flashdiag® un kit pour détecter l'ADN du phytoplasme directement sur site, à savoir à proximité des vignes.

Le test repose sur des techniques de biologie moléculaire permettant de détecter des séquences spécifiques d'ADN du pathogène. Il est réalisable en une heure hors d'un laboratoire, par exemple dans un chai, un hangar, chez le distributeur... L'intérêt est de permettre une prise en charge de la maladie et une orientation des échantillons prospectés bien plus rapide.

Prototype validé au laboratoire

En collaboration avec l'Inra de Bordeaux, la validation d'un premier prototype a été entreprise. Au deuxième semestre 2014, les équipes de recherche et développement d'Anova-Plus et de Xavier Foissac (équipe Mollicutes) de l'unité de biologie du fruit et pathologie (UMR 1332) de l'Inra de Bordeaux ont réalisé un premier travail de validation (Rodolphe Y. & al., 2015).

Ils ont vérifié la spécificité et la sensibilité de ce kit, nommé Vitikit® FD, comparé à la méthode officielle.

Quarante-sept extraits d'ADN brut totaux de pieds de vignes symptomatiques de la FD (extraits à partir d'un tampon d'extraction utilisable seulement au laboratoire, le CTAB) ont été analysés à la fois par la méthode officielle MOA 006 2b et par le prototype au laboratoire Inra.

Les résultats ont montré une corrélation de 97 % entre les deux méthodes, au niveau de l'amplification et de la révélation, attestant la sensibilité et la spécificité du kit (voir Tableau 1).

Première étape de validation terrain

Avec pour objectif de transposer le kit du laboratoire au terrain et parallèlement à l'analyse des extraits d'ADN, le GDON libournais, avec la participation de l'équipe R&D d'Anova-Plus et de l'Inra de Bordeaux, a réalisé une collecte terrain de 99 échantillons de feuilles de vigne, dont 41 présentaient des symptômes attribuables à la FD. En partenariat avec l'Inra de Bordeaux, deux types d'analyses ont été réalisées à partir de chaque échantillon, la première avec la méthode officielle MOA 006 2b où l'ADN brut était extrait avec le tampon CTAB et la deuxième analyse à partir du prototype, mais avec un ADN brut extrait avec un tampon d'extraction NaOH (2 %). Ce tampon avait été choisi car il est utilisable directement sur le terrain.

Ces travaux ont montré une corrélation du prototype de 55 % avec la méthode officielle (MOA 006 version 2b). La méthode d'extraction n'était donc pas adaptée à la vigne (Tableau 1). Par ailleurs, le kit ne présentait aucune réaction croisée avec le phytoplasme responsable du bois noir et d'autres phytoplasmes connus pouvant infecter la vigne. Ainsi, le point à améliorer pour rendre le kit utilisable sur le terrain était le mode d'extraction de l'ADN des échantillons à partir de feuilles de vigne.

Vers un prototype amélioré

Suite à ces premiers résultats, le service recherche et développement d'Anova-Plus est parvenu à améliorer le tampon d'extraction et à réduire le nombre d'étapes. Cela a abouti à un second prototype présentant à la fois :

- un nombre d'étapes réduit pour un kit plus convivial et aisément utilisable sur site ;

- une corrélation proche de 97 % par rapport à la méthode officielle.

Validation à grande échelle

Nouveau partenariat

Courant 2015, Anova-Plus a noué un partenariat avec Phyteurop pour valider le test à plus grande échelle. Avec l'aide des équipes GDON et Fredon, ils ont collecté des échantillons sur cinq terroirs viticoles français représentatifs du vignoble touché par la FD. L'objectif était de valider le second prototype en corrélant les résultats du kit avec ceux de la méthode officielle (MOA 006 2b) effectuée dans un laboratoire agréé (LDA71 : Laboratoire départemental d'analyse de Saône-et-Loire).

Collecte et préparation des échantillons de vignes françaises

La collecte, réalisée entre la fin de l'été et le début de l'automne 2015, a permis de rassembler 3 034 échantillons de feuilles de vigne, sur cinq terroirs français (Bordeaux, Cognac, Drôme, Aude et Bourgogne) avec les équipes de GDON et Fredon de chaque région, de Phyteurop et d'Anova-Plus (voir Tableau 2).

Ces échantillons ont été répertoriés selon le degré visible de la maladie (phénotype) :

- un échantillon était noté 1 s'il était visiblement sain (asymptomatique : ne présentant aucun symptôme) ;

- si l'échantillon présentait deux symptômes, il était noté 2 ;

- 3 à 4 signifiait qu'il présentait trois à quatre symptômes de la maladie, donc était supposé très malade (Tableau 3).

Des échantillons supposés sains ont été prélevés comme témoins (Tableaux 2 et 3). Sur les 3 034 échantillons, 590, soit une moyenne de 110 par région, ont fait l'objet d'analyses officielles (MOA 006 version 2b, sur ABI 7500) par le LDA 71 et d'analyses avec le kit terrain.

Chaque échantillon d'une dizaine de pétioles (prélevés sur un seul cep) a été divisé en deux. Précisément, chaque pétiole a été coupé en deux. Pour chaque échantillon, dix moitiés de pétioles ont été envoyées au LDA71 en moins de 48 heures. Les dix autres moitiés ont fait l'objet de tests de terrain Vitikit FD en deux réplicas, soit deux tests par échantillon. Les résultats d'analyses de ces 590 échantillons sont présentés ici.

Méthodes moléculaires comparées

Les analyses moléculaires officielles (MOA 006 2b) sur échantillons de vigne supposés contaminés à la FD visent à détecter l'ADN du phytoplasme responsable de la FD par PCR en temps réel (real time polymerase chain reaction). Ces analyses ont été réalisées par le LDA 71. Cette méthode officielle, dite Triplex, détecte le phytoplasme responsable de la flavescence dorée et celui responsable du bois noir de la vigne, en différenciant les deux organismes ; elle permet de confirmer la contamination des tissus analysés. Uniquement réalisable en laboratoire, cette méthode exige au moins une journée et comprend trois étapes : l'extraction de l'ADN, son amplification par une PCR en temps réel à l'aide d'un thermocycleur (ABI 7500 au LDA 71), et l'analyse des résultats.

Le kit terrain Vitikit FD, qui détecte seulement la FD, est basé sur une méthode de biologie moléculaire par amplification isotherme d'une séquence d'ADN spécifique. Sa mise en oeuvre nécessite également trois étapes : extraction de l'ADN, amplification isotherme (encadré ci-dessus) à l'aide d'un bloc chauffant à 39 °C durant 20 min, révélation par bandelette immunologique présente dans une cassette (une bande : test négatif, deux bandes : test positif, voir photo 2).

Au sein du laboratoire recherche et développement d'Anova-Plus, la méthode officielle (MOA 006 2b, sur Light Cycler 480 Roche) a été internalisée pour identifier, parmi les résultats négatifs à la FD, les échantillons infectés par le BN (le kit terrain ne détectant que la FD). Les analyses ont été réalisées sur les 590 extraits d'ADN des échantillons obtenus avec le kit terrain. Pour les deux technologies, les extractions d'ADN ont été réalisées à partir de pétioles. Les résultats sont reportés Figure 1.

Résultats

97 % de corrélation du kit avec la méthode officielle

Sur les 3034 échantillons collectés, 590, soit 19 %, ont été analysés en parallèle avec les deux méthodes : MOA 006 2b et Vitikit FD. Sur ces 590 échantillons, le LDA71 a révélé que 66 % étaient infectés par la flavescence dorée, 22% par le bois noir, 1 % co-infectés par la flavescence dorée et le bois noir et 11 % sains (Figure 1 et Tableau 4).

Sur le terrain, chaque échantillon a été testé deux fois (une répétition) avec le kit Vitikit FD. Les résultats montrent 66 % d'échantillons infectés par la flavescence dorée et 34 % non infectés par cette maladie.

Les analyses par méthode officielle (MOA 006 2b) réalisées au sein du laboratoire d'Anova-Plus confirment les résultats du LDA71. En effet, en détaillant les résultats, on observe que 23 % des échantillons sont positifs au bois noir et 11 % ne sont pas infectés par la flavescence dorée ni par le bois noir (Figure 1 et Tableau 4). Sur les 590 échantillons, 19 ont des résultats différant entre le laboratoire officiel et le kit terrain. Cette différence pourrait s'expliquer par une hétérogénéité de la répartition des phytoplasmes au sein du pétiole(1).

En conclusion, les résultats permettent de calculer une corrélation de 97 % entre la méthode officielle et le kit terrain (voir Figure 1 et Tableau 4).

Évaluation de la répétabilité

La répétabilité du test Vitikit FD a été calculée sur les 590 échantillons ayant aussi été analysés par le LDA71. Seuls neuf échantillons se sont révélés +/- pour la FD (contradiction entre les deux analyses du même échantillon avec le kit) et, donc, non répétables. Soit moins de 2 % (1,86 %).

Par ailleurs, dix tests sont répétables mais avec un résultat différent de celui du LDA 71 : le test terrain donne un résultat négatif pour huit échantillons (-/-) et un résultat positif pour deux (+/+) alors qu'ils sont respectivement positifs (+) et négatifs (-) selon l'analyse du LDA 71 (Tableau 5).

À noter, sur les 113 échantillons issus de la région Bourgogne, un seul était infecté par la flavescence dorée. Deux points importants sont à souligner : d'une part les symptômes des deux maladies se ressemblent, et d'autre part le kit terrain détecte bien spécifiquement la flavescence dorée, confirmant les premiers résultats issus de la collaboration avec l'Inra de Bordeaux.

Possibilité de détection précoce, avant tout symptôme ?

Malgré des critères définis lors de la collecte des échantillons, le phénotypage peut présenter des variations, selon les régions, l'ensoleillement, les personnes réalisant la collecte (appréciation des symptômes) et les cépages. Ainsi, selon les experts, les cépages sauvignon et cabernet-sauvignon expriment davantage les symptômes que les merlot et sémillon.

Concernant les échantillons indice 2 (deux symptômes), 75 % se sont révélés positifs FD. Ce chiffre s'élève à 94 % pour les indices 3 et 4 (trois ou quatre symptômes) ; 7 % des échantillons classés 1 (pas de symptômes visibles) sont infectés par la FD (voir Figure 2). Le phénotypage a donc été plutôt bien réalisé malgré le grand nombre de préleveurs.

Revenons sur le fait que onze échantillons asymptomatiques se sont révélés positifs, en PCR temps réel comme avec le kit terrain. Ceci suggère que ce kit pourrait détecter la flavescence dorée très tôt avant la survenue des symptômes. Bien entendu, ce résultat devra être conforté sur un plus grand nombre d'échantillons.

Conclusion : un nouvel OAD

Après développement de plusieurs prototypes et étapes de validation sur le terrain, Vitikit FD est un outil fiable montrant une corrélation de 97 % avec la méthode officielle MOA 006 2b.

Outre sa fiabilité, l'outil est directement utilisable sur le terrain et permet d'obtenir des résultats rapidement : en moins d'une heure une dizaine d'échantillons peuvent être testés. Ce véritable outil d'aide à la décision (OAD) permettra d'orienter rapidement l'agent de terrain (technicien, viticulteur...) quant aux stratégies à mettre en place contre la flavescence dorée.

De plus, avec une méthode d'échantillonnage efficace, sa sensibilité pourrait lui permettre de détecter la maladie précocement.

La commercialisation par Phyteurop a débuté l'été 2016 (photo 3). La prochaine étape consistera à récolter les retours du terrain quant à l'usage de ce kit de détection.

(1) Nynne Meyn Christensen and al., « Distribution of Phytoplasmas in Infected Plants as Revealed by Real-Time PCR and Bioimaging », The American Phytopathological Society, MPMI Vol. 17, n° 11, 2004, p. 1175-1184.