Recherches de biomolécules issues de micro-organismes

Une équipe pluridisciplinaire travaille sur les potentialités de lipopeptides bactériens contre des maladies du blé, de la pomme de terre et du poireau.

La lutte contre les maladies du blé, de la pomme de terre, du poireau et de l'oignon utilise surtout des intrants d'origine chimique et fait face à une quasi-absence de produits biologiques efficaces. Ce dernier type de produits est l'objet des recherches rapportées ici.

La quête du naturel

Lipopeptides bactériens : de bons candidats

Afin de répondre aux attentes de produits de biocontrôle des agriculteurs conventionnels et biologiques, la mise sur le marché de molécules naturelles biodégradables et moins toxiques que les molécules actuellement utilisées est une piste prometteuse. Les lipopeptides produits par des bactéries du genre Bacillus sont de bons candidats potentiels pour répondre à cette problématique (Ongena et Jacques, 2008).

Les lipopeptides produits par l'université Lille 1 (Institut Charles Viollette) ont été testés par quatre partenaires (ISA-ICV, Fredon, UCEIV, Pôle légumes région Nord) pour leur efficacité à lutter contre la septoriose du blé (Zymoseptoria tritici), le mildiou de la pomme de terre (Phytophthora infestans), la maladie des racines roses de l'oignon (Pyrenochaeta terrestris) et la fusariose du poireau (Fusarium culmorum). Ceci en conditions contrôlées, semi-contrôlées et au champ avec contamination artificielle.

Le travail réalisé

Différents lipopeptides ont été évalués, seuls ou en association et à différentes concentrations, afin de réaliser un criblage visant à sélectionner les lipopeptides et les concentrations les plus efficaces sur ces différents pathosystèmes.

Production des lipopeptides

Les trois lipopeptides utilisés dans ces travaux ont été produits à partir de souches de B. subtilis capables de produire chacune des lipopeptides seuls ou en mélange. Ces souches ont été préalablement développées à l'ICV de l'université Lille 1.

La souche BBG125 a été utilisée pour produire de la mycosubtiline et la souche BBG116 pour produire un mélange mycosubtiline/surfactine (Béchet et al., 2013). Elles ont été cultivées selon le procédé dit Overflowing exponential fed-batch culture décrit par Chenikher et al. en 2010.

La souche BBG131 a été utilisée pour la production de surfactine (Coutte et al., 2010) et la souche BS2504 pour la production de fengycine (Ongena et al., 2007). Ces deux souches ont été cultivées dans un procédé intégré de production et de purification, appelé Continuous bubbleless membrane bioreactor, décrit par Coutte et al. en 2013.

Une fois produits, les lipopeptides ont été purifiés grâce à un procédé séquentiel utilisant des étapes d'ultrafiltration, de diafiltration, d'évaporation et de lyophilisation (Coutte et al., 2013). La pureté des différentes poudres de lipopeptides obtenues a ensuite été vérifiée par RP-HPLC.

Six préparations testées in vitro sur trois champignons

Des boîtes de Petri ont été préparées avec un milieu de croissance du champignon (potato dextrose agar ou PDA) contenant des concentrations croissantes (2,5 ; 5 ; 10 ; 50 et 100 mg/l de six préparations de lipopeptides, seuls ou en mélange : surfactine (S), mycosubtiline (M), fengycine (F), surfactine-mycosubtiline (SM 50/50), surfactine-fengycine (SF 50/50) et surfactine-mycosubtiline-fengycine (SMF 33/33/33).

Des explants de champignon de 6 mm de diamètre prélevés par un emporte-pièce sur une culture de F. culmorum et de P. terrestris sont déposés sur les différentes boîtes. Pour Z. tritici, une goutte de 5 µl d'une suspension de spores (5 × 105 spores/ml) obtenue après culture liquide du champignon est déposée. La croissance est évaluée en mesurant le diamètre des cultures issues des patchs ou de la goutte, le champignon se développant de manière radiale sur les boîtes.

Selon l'espèce de champignon, les mesures ont été faites à des temps différents, en tenant compte de la vitesse de croissance de chacune d'entre elles. Ainsi, F. culmorum et P. terrestris ont été cultivés à 20 °C à l'obscurité et Z. tritici à 20 °C sous un régime photopériodique de 12 heures à la lumière et 12 heures à l'obscurité.

Pour F. culmorum, les observations ont été réalisées à 48 h, 96 h et 9 j de culture. Pour P. terrestris, elles ont été réalisées à 96 h, 8 j et 20 j et pour Z. tritici à 8 j et 20 j.

Essai septoriose sur blé sous serre

Le niveau de protection des lipopeptides contre Z. tritici a été évalué en serre sur des plantes de blé au stade quatrième feuille sortante, selon le protocole décrit par Siah et al. (2010). Les essais ont été réalisés en utilisant la variété Alixan (sensible à la septoriose) et la souche T02596 (isolée en 2014 dans le nord de la France). Les lipopeptides sont tout d'abord solubilisés dans du DMSO à 0,1 % puis dilués dans une solution d'eau distillée pour obtenir les concentrations souhaitées (200, 100 et 50 mg/l).

Les lipopeptides sont ensuite appliqués 48 h avant inoculation à l'aide d'un pulvérisateur manuel après l'ajout de Tween 20 à 0,05 % permettant l'adhésion des lipopeptides sur les feuilles de blé. Trente-six plantes (trois pots de douze plantes) sont utilisées par modalité.

Par ailleurs, trois témoins sont intégrés dans l'étude : un témoin non traité non inoculé, un témoin non traité inoculé et un témoin traité avec le Tween 20 seul et inoculé. L'efficacité (réduction des symptômes en valeur relative par rapport au témoin non traité) des produits sur les symptômes (pourcentage de surface foliaire malade avec nécroses ou chloroses contenant des pycnides) a été mesurée sur la troisième feuille à 21 jours post-inoculation.

La comparaison des moyennes pour le niveau des symptômes foliaires a été réalisée avec le test Anova de Tukey à P = 0,05, à l'aide du logiciel XLSTAT (Addinsoft).

Essai en salle climatisée sur le mildiou de la pomme de terre

L'efficacité des lipopeptides contre le mildiou de la pomme de terre dû à P. infestans a été étudiée en salle climatisée. La variété choisie est la Bintje : c'est la plus implantée en région et elle est préconisée par la commission des essais biologiques du fait de sa sensibilité au mildiou (Petitprez, 2002).

Les tubercules sont plantés dans des pots de 12 centimètres de diamètre avec du terreau non autoclavé. La température est maintenue à 20 °C pendant deux jours pour permettre une germination rapide, puis elle est passée à 15 °C afin d'obtenir des plants compacts qui facilitent les manipulations. La photopériode est de 16 heures de jour/8 heures de nuit. Une parcelle élémentaire est constituée de dix plants de pommes de terre. Il y a quatre répétitions, soit quarante plantes par modalité.

Les modalités testées en 2016 sont précisées dans le Tableau 1. L'application a lieu à l'aide d'un pulvérisateur à rampe qui simule un traitement au champ. Le volume appliqué est de 300 l/ha. Les lipopeptides sont solubilisés dans une solution de DMSO à 0,1 %. L'inoculation a été réalisée à l'aide d'une suspension de spores deux jours après le traitement. La solution comprend 64 000 spores/ml. Afin de faciliter l'accroche des gouttelettes sur la feuille, du Tween 20 a été utilisé comme agent mouillant. La pulvérisation des spores est réalisée à raison de 10 ml de solution contaminante pulvérisée sur chaque plante. Une fois pulvérisée, la plante est placée sous sac plastique afin d'optimiser l'hygrométrie. Le sac est laissé jusqu'à développement des symptômes.

Le traitement a été effectué le 18 juillet 2016. La contamination artificielle a eu lieu à T + 2, soit le 20 juillet.

La notation des symptômes a été réalisée le 28 juillet (T + 10 jours). Elle a consisté en la mesure du pourcentage de destruction foliaire sur les quatre feuilles développées de chaque plante. L'analyse statistique est le test de Newmaan et Keuls (5 %) réalisée avec le logiciel Statbox.

Essai fusariose du poireau au champ

Les lipopeptides ont été évalués au champ sur la fusariose du poireau. Les essais sont menés avec une variété sensible, le Krypton. Les modalités comparées sont :

- des lipopeptides purs ou en mélange (trois modalités) ;

- du Prestop (Gliocladium catenulatum J1446) utilisable en AB ;

- du Topsin (thiophanate-méthyl) utilisable en agriculture conventionnelle.

- deux témoins contaminés et un non contaminé.

Elles sont présentées dans le Tableau 2.

Les poireaux ont été semés en tunnel en mars 2016. Les plants ont été arrachés le 16 juin 2016 puis stockés au froid pendant 15 jours pour vieillissement. Le 4 juillet 2016, les poireaux ont été trempés dans une solution de lipopeptides pendant une heure. Ils ont ensuite été égouttés puis plantés le lendemain. La contamination des plants a lieu dix jours après plantation par une solution de 50 litres d'eau préparée avec le contenu de douze boîtes de F. culmorum et douze boîtes de P. terrestris. Onze parcelles (huit modalités et trois témoins) de soixante poireaux ont été préparées avec quatre répétitions.

L'efficacité des molécules est évaluée par l'analyse du rendement commercialisable, les pertes à la récolte et le poids des racines.

Résultats et discussion

Effet sur le développement des trois champignons en boîte de Petri

Fusarium culmorum est très sensible à la fengycine et aux mélanges contenant la fengicine même aux plus faibles concentrations à 48 h et 96 h. En effet, un fort pourcentage d'inhibition de la croissance du champignon est observé. En revanche, après neuf jours, l'effet est beaucoup moins visible et même absent pour le mélange SMF.

La mycosubtiline a un effet moindre, visible seulement aux concentrations les plus élevées (50 et 100 mg/l). Un petit effet est observé pour la surfactine à 96 h, mais seulement aux concentrations les plus élevées.

Pyrenophora terrestris est également très sensible à la fengycine et aux mélanges en contenant dès les plus faibles concentrations. Le mélange surfactine-fengycine est le plus efficace. Comme pour F. culmorum, l'effet sur la croissance du champignon s'estompe avec le temps : à vingt jours, le taux d'inhibition de croissance a diminué.

Enfin, il existe un léger effet de la mycosubtiline, mais seulement aux concentrations les plus élevées.

En revanche, c'est à la mycosubtiline que Z. tritici est le plus sensible : dès 5 mg/l, une inhibition totale de la croissance du champignon est observée. Les mélanges contenant la mycosubtiline ont le même effet. Au cours du temps, la fengycine semble retarder la croissance du champignon aux concentrations les plus élevées.

Ainsi, certains lipopeptides ont un effet parfois très important sur la croissance des trois champignons phytopathogènes testés. L'activité inhibitrice diffère selon le champignon visé : elle est « espèce dépendante ». Pour chaque organisme fongique, il conviendra donc de tester le lipopeptide le plus efficace.

Action contre Z. tritici sur blé en serre

Dans le test sur plants de blé sous serre, les notations ont révélé une réduction significative des symptômes sporulant sur toutes les plantes traitées avec les lipopeptides (Figure 1).

Les réductions les plus importantes sont obtenues par les formulations contenant de la mycosubtiline. Toutefois, la fengycine, seule ou en association avec la surfactine, a montré un bon niveau d'efficacité. Les efficacités observées ne sont pas influencées de façon très marquée par les différentes concentrations utilisées.

Cette étude a mis en évidence un bon niveau de protection du blé contre la septoriose par la mycosubtiline (seule ou associée à la surfactine et la fengycine), avec des réductions de la maladie allant jusqu'à 60 % par rapport au témoin non traité. Les travaux de caractérisation in vitro et in planta suggèrent que le mode d'action de ce lipopeptide serait essentiellement basé sur un effet biofongicide direct sur le champignon : effet sur la germination des spores et la croissance mycélienne (non montré).

La fengycine, seule ou associée avec la surfactine, a montré des niveaux significatifs de protection, avec des réductions de la maladie allant jusqu'à 55 % par rapport au témoin non traité. Le mode d'action de ce lipopeptide pourrait être dû à un effet stimulateur de défenses de la plante. En effet, aucun effet biocide direct de cette substance n'a été détecté en conditions in vitro et in planta (sauf pour le mélange S+F in vitro).

L'effet stimulateur de défenses des plantes de toutes les formulations testées sera évalué ultérieurement à l'aide de marqueurs biochimiques et moléculaires afin d'identifier les voies de défense potentiellement élicitées par les traitements.

Effet des lipopeptides contre le mildiou de la pomme de terre causé par Phytophthora infestans

L'infestation de l'essai a été validée avec des témoins présentant en moyenne 53 et 51 % de surface foliaire atteinte par le mildiou. Les résultats montrent que le traitement préventif avec les différents lipopeptides testés en 2016 a permis de réduire la sévérité de la maladie de manière statistiquement significative (Figure 2).

La surfactine à une concentration de 100 mg/l a permis de réduire de 37 % les symptômes. Ce lipopeptide est celui qui a eu le moins d'effet dans les conditions de cette étude et qui est statistiquement inférieur à la référence chimique et la référence agriculture biologique.

Les traitements avec les autres lipopeptides ont permis de réduire de 69 à 92 % l'impact de la maladie. Leurs effets ne sontt pas statistiquement différenciables les uns des autres du fait de la superposition des groupes issus du test de Newman et Keuls (5 %). Ces résultats encouragent à poursuivre les études sur ces lipopeptides. Par ailleurs, les trois années d'études ont permis d'affiner la méthodologie de mise en oeuvre de ce type d'étude en salles climatiques (température, modalités d'inoculation...).

Essais fusariose du poireau

L'infection des plants de poireaux a été très faible lors des essais réalisés en 2015 et 2016. Il est donc difficile d'évaluer l'activité des lipopeptides sur la fusariose du poireau. Néanmoins, les modalités à base de lipopeptides permettent de dégager des tendances positives sur les rendements de poireaux commercialisables par rapport au témoin sans lipopeptide (Figure 3).

Cette tendance se confirme aussi sur le rendement de matière sèche. De plus, pour l'ensemble des modalités traitées avec des lipopeptides, le système racinaire est plus développé, d'où un poids de racines supérieur à celui des témoins (non montré).

Conclusion

Les résultats obtenus dans le cadre du projet Newbiopest concernant l'utilisation des lipopeptides produits par Bacillus subtilis comme futurs biopesticides sont très prometteurs. L'efficacité de ces molécules a été montrée sur différentes maladies des plantes ou sur les micro-organismes qui en sont responsables, à l'échelle du laboratoire, sous serre, en salle climatisée et au champ.

La nature des molécules ou des mélanges a été déterminante sur le développement de trois champignons phytopathogènes : Fusarium culmorum, Pyrenochaeta terrestris et Zymoseptoria tritici.

Un effet de protection des feuilles de blé vis-à-vis de la septoriose et des feuilles de pomme de terre vis-à-vis du mildiou a été montré, avec comme principal résultat une réduction significative de la surface foliaire avec symptômes. Il n'a pas été possible de conclure sur la fusariose du poireau car le niveau d'infection était trop faible lors des essais. Néanmoins, une augmentation des rendements commerciaux à l'hectare a été obtenue avec les lots traités par des lipopeptides.

Ces résultats encourageants confirment l'utilisation potentielle en tant qu'outils de biocontrôle des lipopeptides issus de Bacillus subtilis. Ceci permet d'envisager d'utiliser ces molécules contre les agents phytopathogènes testés ici et qui ont un impact économique notable sur les cultures.

*Université de Lille, Inra, université d'Artois, université du Littoral Côte d'Opale, Institut Charles Viollette. **Fredon Nord Pas-de-Calais.***Unité de chimie environnementale et interactions sur le vivant. ****Institut Charles Viollette, Institut supérieur d'agriculture. *****Pôle Légumes Région Nord.