Des substances testées au laboratoire, sous serre ou au champ se montrent prometteuses comme agents de biocontrôle aux multiples facettes.

On le sait, l'efficacité phytosanitaire de certains microorganismes utilisés comme biopesticides est liée à des substances qu'ils produisent. Mais que penser de ces substances si on les extrait du microbe pour les utiliser seules ? Voici des réponses pour une catégorie précise, celle des lipopeptides d'origine bactérienne.

Un contexte

Une utilisation encore très minoritaire mais réelle

Certes, le marché mondial des produits phytosanitaires, qui représentait 44 milliards de dollars en 2011, est largement dominé par les produits de synthèse. Mais certains de ces composés posent différents problèmes environnementaux et de santé humaine, en particulier pour les agriculteurs qui les manipulent à haute concentration. En Europe, la pression politique s'accentue pour réduire l'utilisation de ces pesticides. En France particulièrement, suite au Grenelle de l'environnement, le plan Ecophyto a été mis en place avec pour objectif une réduction de 50 % de ces pesticides de synthèse. Parmi les options envisagées, il y a la substitution de ces composés chimiques par des produits d'origine biologique.

Certains de ces agents de biocontrôle sont des organismes vivants (plantes, insectes, nématodes ou micro-organismes), d'autres sont des produits issus d'organismes vivants. Tous ont pour vocation d'empêcher ou de ralentir le développement des bioagresseurs des cultures. Ces produits représentent encore aujourd'hui un très faible pourcentage de l'ensemble des produits phytosanitaires mais leur marché est en nette croissance (environ 8 % par an pour l'Europe et les États-Unis au cours de ces dernières années).

Les Bacillus spp. utilisés vivants, et très étudiés

Les produits à base de micro-organismes (bactéries, champignons et virus) représentent environ 30 % de ces biopesticides et de nouveaux produits sont régulièrement mis sur le marché.

Parmi eux, le genre bactérien le plus représenté est Bacillus. L'espèce la plus connue est Bacillus thuringiensis : les bio-insecticides le contenant représentent près de 70 % des ventes mondiales de biopesticides bactériens et sont autorisés sur de nombreuses cultures en France. Mais on trouve aussi des produits contenant Bacillus subtilis (autorisé en France), ou encore Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus ou Bacillus licheniformis, agents de contrôle des maladies du sol ou de pré- ou post-récolte dues à des champignons (Ongena and Jacques, 2008), et plus récemment Bacillus firmus (autorisé en France en traitement du sol contre les nématodes).Le mode d'action des Bacillus a été très étudié au cours de ces dernières années. Il résulte de ces travaux que la biosynthèse de molécules lipopeptidiques est un des mécanismes d'action majeur de ces bactéries.

Les lipopeptides, présentation

Ces molécules sont constituées d'un cycle peptidique lié à une chaîne d'acide gras. Elles ont été répertoriées en fonction du nombre, de la nature et de l'isomérie des acides aminés présents dans le cycle peptidique en trois grandes familles : les surfactines, les iturines (dont la mycosubtiline) et les fengycines (Figure 1).

Ce sont des molécules amphiphiles, c'est-à-dire qu'elles « aiment » (ont des affinités avec) deux milieux différents, ici l'eau et les lipides. En effet, leur partie peptidique est plutôt soluble dans l'eau (hydrophile) et leur partie lipidique est plutôt soluble dans l'huile (partie hydrophobe ou lipophile). Cette particularité a des conséquences sur les propriétés physico-chimiques de ces molécules mais aussi sur leurs activités biologiques. Certaines molécules, telle la surfactine, sont ainsi de puissants surfactants (agent moussant ou émulsifiant).

Publiée en 2008, la revue de Marc Ongena et Philippe Jacques dans Trends in Microbiology (Ongena and Jacques, 2008) a, pour la première fois, fait le bilan des propriétés de ces molécules à mettre en relation avec l'activité de biocontrôle des Bacillus spp. Ces propriétés sont de trois natures :

1) Des lipopeptides (essentiellement les surfactines) favorisent la croissance invasive de la souche qui les produit donc potentiellement la colonisation des racines et des feuilles.

2) Des lipopeptides (essentiellement les fengycines et les iturines) inhibent la croissance et/ou la germination d'un grand nombre de champignons phytopathogènes.

3) Des lipopeptides (essentiellement les surfactines et les fengycines) sont des stimulateurs des défenses naturelles des plantes.

Bacillus spp. vivants, des conditions pour leur efficacité

L'efficacité des Bacillus spp. vivants en tant qu'agents de biocontrôle, nécessite un certain nombre d'événements séquentiels : l'adsorption de la souche à proximité de la plante (rhizosphère) ou à la surface de cette dernière (rhizoplan ou surface des organes aériens), sa croissance et enfin la production des molécules responsables de son activité de biocontrôle, les lipopeptides.

Ces successions d'événements constituent un des éléments qui peut, en partie, expliquer une plus faible reproductibilité des résultats obtenus avec ce type de produits comparés à ceux obtenus avec des produits de synthèse classique. Il était logique de se demander s'il ne serait pas intéressant d'appliquer directement les molécules actives.

Un projet débute en 2009

Objectifs, partenaires et enjeux du travail de recherche

Cette réflexion a été à la base du projet Interreg IV Phytobio. Initié en 2009, ce projet a rassemblé cinq centres universitaires dont trois en France (l'université Lille 1 Sciences et Technologies, l'université de Reims Champagne-Ardenne et l'université du Littoral-Côte d'Opale), deux en Belgique (l'université de Gand et l'université de Liège-Gembloux Agro-Bio-Tech), ainsi que deux centres belges de recherche appliquée (Inagro et le Centre provincial de la recherche appliquée des cultures maraîchères, alias PCG) et un syndicat d'agriculteurs français (le Gabnor).

Ce projet, qui s'inscrivait dans une démarche de mise en place d'une agriculture plus durable, visait à découvrir et produire de nouvelles molécules biopesticides et/ou stimulatrices des défenses des plantes et à promouvoir leur utilisation. Dans cette optique, les chercheurs ont focalisé leurs travaux sur les lipopeptides afin de développer leur exploitation directe.

Démarche scientifique (Figure 2)

Par le biais de tests d'activité antimicrobienne in vitro et grâce à des outils bio-informatiques, de nouvelles molécules d'origine bactérienne à potentiel biopesticide ont été sélectionnées. Toutes sont de nature lipopeptidique et sont produites par des bactéries des genres Bacillus, Paenibacillus ou Pseudomonas.

Des souches mutantes surproductrices ou non productrices de ces molécules ont été construites afin de confirmer et évaluer, sous conditions confinées au laboratoire, le rôle de ces molécules dans le biocontrôle d'agents pathogènes dans différents pathosystèmes (Coutte et al., 2010 ; Béchet et al., 2013).

Des procédés de production en bioréacteurs de ces molécules ont été développés afin d'évaluer ces molécules en phytotron, en serre et au champ.

Par ailleurs, des premiers tests d'écotoxicité ont été réalisés sur Vibrio (Test Microtox) et daphnies. La phytotoxicité vis-à-vis de différentes espèces végétales a également été évaluée.

Des résultats très prometteurs

Découvertes de nouveaux lipopeptides issus de Pseudomonas spp.

Un nouveau lipopeptide produit par des souches de Pseudomonas a été mis en évidence par un travail collaboratif entre l'université de Gand, Gembloux AgroBioTech et l'université Lille 1. Ce lipopeptide linéaire appelé cichofactine est produit par Pseudomonas cichorii, une souche pathogène de la chicorée. La cichofactine est probablement impliquée dans la virulence de la souche (Pauwelyn et al., 2014).

Par ailleurs, deux lipopeptides cycliques (la sessiline et un membre de la famille des orfamides) sécrétés par Pseudomonas CMR12a, une souche potentiellement utilisable dans le biocontrôle, ont également été identifiés. Ces lipopeptides favorisent la croissance invasive de Pseudomonas et la formation de biofilms (D'aes et al., 2014).

Étude du mécanisme d'action des lipopeptides issus de Bacillus subtilis

L'étude du mécanisme d'action des trois principales familles de lipopeptides produites par B. subtilis a été approfondie et étendue à différents modèles par les chercheurs de Gembloux AgroBioTech, de l'université de Reims, de l'université de Gand et de l'université du Littoral.

Les travaux ont confirmé les propriétés inductrices de résistance systémique de la surfactine (Cawoy et al., 2014). Elle agirait en modifiant l'organisation de la répartition des protéines dans la membrane cytoplasmique de la cellule végétale (Henry et al., 2011). Ils ont aussi démontré que la mycosubtiline est capable d'inhiber la germination des spores de Mycosphaerella graminicola, agent de la septoriose du blé. Par ailleurs, elle est capable d'induire l'expression de gènes impliqués dans les mécanismes de défense chez des cellules de vigne en culture. Ce lipopeptide est très actif envers d'autres pathogènes tels que Botrytis cinerea et Fusarium oxysporum qui s'attaquent à de très nombreuses espèces végétales.

Production des lipopeptides, procédé mis au point

Un procédé de production et purification en continu des lipopeptides mis au point par les chercheurs de l'université Lille 1 a été exploité pour produire les quantités nécessaires aux tests des molécules en serres et aux champs.

Ce procédé basé sur la technologie du bioréacteur à membrane a été mis au point pour la première fois pour la production des lipopeptides de B. subtilis. Il intègre une étape de production utilisant un contacteur air/liquide à membrane couplé au bioréacteur, une étape de microfiltration permettant de séparer les cellules des lipopeptides et une étape d'ultrafiltration qui concentre et purifie les lipopeptides en continu (Coutte et al., 2013).

Ce procédé intégré innovant permet d'obtenir une productivité satisfaisante et un taux de pureté des lipopeptides dépassant 90 %. Ces résultats encourageants laissent espérer une exploitation à l'échelle industrielle.

Efficacité in vivo des lipopeptides de B. subtilis sur raisin, laitue et poireau

Des essais ont été réalisés pour la première fois en phytotron, en serre et au champ avec divers pathosystèmes pour évaluer in vivo l'efficacité des lipopeptides de B. subtilis.

Ces molécules se sont montrées particulièrement efficaces contre l'infection post-récolte des raisins par Botrytis cinerea (Figure 3) et contre le mildiou (Bremia lactucae) de la laitue (Figure 4). Des résultats préliminaires intéressants ont été obtenus contre la fusariose (Fusarium culmorum) du poireau (Figure 5).

L'effet du mélange surfactine-mycosubtiline sur l'infection post-récolte des raisins par Botrytis cinerea a été testé en phytotron en 2012 par l'université de Reims Champagne-Ardenne. L'expérience a montré une forte réduction de la contamination par B. cinerea suite aux traitements préventifs par le mélange de lipopeptides (Figure 3).

L'action de la mycosubtiline sur le mildiou de la laitue a été étudiée en serre par l'université de Gand et le PCG début 2011. Le traitement préventif (effectué la veille de l'infection) a permis d'augmenter le nombre de plantes saines et de réduire la sévérité de la maladie de façon statistiquement significative (Figure 4).

Enfin, différents lipopeptides ont été testés au champ contre la fusariose du poireau, comparés avec des pesticides chimiques et des biopesticides à base de micro-organismes vivants. Les expériences, réalisées par le PCG en 2012, ont consisté à appliquer les molécules lors du repiquage avant insémination artificielle au champ. Elles suggèrent l'intérêt en particulier de la fengycine et du mélange surfactine + mycosubtiline (Figure 5).

Études de l'écotoxicité : des résultats préliminaires prometteurs

Les tests d'écotoxicité réalisés sur Vibrio et daphnies font apparaître les lipopeptides parmi les molécules fongicides les moins toxiques, comparées à différents produits de synthèse, pour ce qui est de leur toxicité aiguë sur ces organismes.

À titre d'exemple, la surfactine (EC50 > 450 mg/l) présente une toxicité aiguë vis-à-vis de Vibrio qui est plus de 4 000 fois inférieure à celle du dithianon (EC50 = 0,116 mg/l). De même, sa toxicité aiguë vis-à-vis des daphnies apparaît 85 fois inférieure à celle de la fenamidone (EC = 17,3 mg/L et 0,2 mg/l respectivement) (Deravel et al., 2014).

Bien entendu, il s'agit ici seulement d'évaluation de toxicité à court terme, pas à long terme. De plus, elle a été étudiée sur deux organismes particuliers (bactérie et microcrustacé), donc pas sur des mammifères. Avant toute autorisation, l'écotoxicité à long terme et la toxicité sur mammifères (aiguë et chronique) devront être évaluées. Mais ces résultats préliminaires sont très déjà encourageants.

Conclusions et perspectives

Ce que l'on sait aujourd'hui

L'efficacité des nouveaux lipopeptides contre différents agents phytopathogènes, testée dans des conditions contrôlées et non contrôlées (proches de celles rencontrées par l'agriculteur), souligne le potentiel de ces molécules en tant qu'agent de lutte biologique. Elles sont d'autant plus intéressantes qu'elles sont biodégradables et semblent, d'après les premiers tests réalisés, présenter une écotoxicité plus faible que les pesticides chimiques utilisés couramment sur ces pathosystèmes.

De plus, les travaux réalisés sur le développement de procédés de production de ces molécules permettent d'envisager une production importante des quantités tout en réduisant le coût.

Par ailleurs, l'étude des mécanismes d'action de ces substances permet d'envisager un usage plus rationnel de celles-ci, par exemple en les pulvérisant au moment le plus opportun. Cela pourrait augmenter leur efficacité tout en réduisant les quantités utilisées.

Ce qui se prépare pour demain

Une start-up, Lipofabrik, a été créée en novembre 2012 à partir du laboratoire ProBioGEM de l'université Lille 1. Son objet est d'assurer la production de ces molécules et leur développement en tant que futurs biopesticides.

La suite du travail portera sur l'amélioration des conditions de production de ces molécules, l'étude de leurs formulations afin de les rendre plus actives et efficaces, l'étude de leur efficacité sur d'autres modèles (pathosystèmes).

Enfin, il est programmé de réaliser une première étude de toxicité aiguë en tant que première étape pour une future demande d'autorisation d'un produit à base de lipopeptides.